随着养殖业的集约化发展，以大量抗生素的使用来实现增产已构成了抗生素在全球范围广泛使用的格局。这导致环境中抗生素的残留和抗性基因的增长逐渐发展成为日益突出的环境问题。因此，在当前新形势下，开展土壤中抗性基因多样性的研究及抗性细菌的筛选对于理解抗生素抗性基因的环境传播机制十分必要。本研究对不同施肥条件下土壤中细菌群落的抗生素抗性基因进行了荧光定量PCR分析，在此基础上从施用畜禽粪肥的土壤中筛选到五株对头孢氨苄具有较强抗性的抗性细菌，并对这些细菌进行了基因组草图测序。结果发现施用化肥对土壤抗生素抗性基因的丰度没有显著性影响，而施用畜禽粪肥可显著增加土壤中抗生素抗性基因的绝对丰度和相对丰度。施用畜禽粪肥的土壤中含有丰富的可培养的头孢氨苄耐药细菌，这些细菌主要含有多重耐药基因，对头孢氨苄的耐药机制为将抗生素外排。本研究结果对深入理解抗生素抗性基因作为一个新型环境污染物的环境行为有较大帮助。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1实验内容2
1.1研究目标 2
1.2材料与方法 3
1.2.1实验材料3
1.2.2实验方法3
2结果与分析6
2.1抗性基因丰度检测10
2.2抗性细菌的分离和鉴定11
3讨论 13
3.1施用畜禽粪肥对土壤中ARGs的影响 13
3.2施用畜禽粪粪肥土壤中抗生素抗性细菌及携带抗性基因的特点 13
致谢13
参考文献14
图1、2、36
图4、5、6 7
图7、8、98
图10、11、129
图13、1410
表14
表2 12
土壤环境中不同抗生素抗性细菌抗性基因多样性研究
引言
引言
抗生素的发现和大规模生产使用是人类医学史上的巨大进步,挽救了数以亿计的病人。抗生素主要应用于医疗和养殖领域。实际上，人们在养殖领域对抗生素的使用和消耗远远高于人们在医疗领域。由于监管的不足，我们对抗生素的滥用还未得 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
到有效的控制。这导致日益严重的环境污染问题。据统计，每年有超过7000t的抗生素投入畜禽养殖业，用于动物的疾病治疗和催速生长［1］。在畜禽养殖业，抗生素的长期滥用能够诱导增加动物肠道内的抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs）［2］。未经吸收的抗生素随着其尿液和粪便排出体外，这些未经处理的粪便中常常含有较多的抗生素和ARGs。如果将这种粪便作为有机肥施入农田，将会增加土壤中抗生素的浓度并改变土壤ARGs的丰度及多样性，这对养殖区域及其周边土壤环境将会造成潜在污染。ARGs可通过基因移动元件（Mobile Genetic Elements, MGEs）在各种环境中的各种微生物之间传播和扩散，对公共健康、食品和饮用水安全是一个很大的安全隐患［3］。对环境微生物抗生素抗性的有效控制，需要我们深入理解土壤ARGs的环境行为。我国是抗生素使用大国，但在ARGs的环境行为和风险评估方面的研究还较为落后。因此，研究土壤ARGs的多样性具有非常重要的意义。
与传统的污染物不同，抗生素抗性基因由于其固有的生物学和传播特性，可在不同细菌间转移，可表现出独有的环境行为［4］，畜禽粪便作为肥料施用和城市再生水灌溉已成为土壤中ARGs的主要来源。我国土壤中抗生素的含量随土地利用类型的不同而差异显著，农田土壤抗生素含量最高。土壤中逐年增加的抗生素对土壤中ARGs的积累起到了正向选择压力的作用［5］。要正确评估ARGs的生态风险、在环境中的分布、传播途径和机制，需要对各个环境介质中的ARGs的多样性以及抗性细菌中ARGs的组成、基因环境和传播能力进行研究。现阶段研究ARGs多样性的研究中，确定ARGs的潜在宿主菌是常见的难点。通过直接筛选环境中的抗性细菌，研究其ARGs的组成组成、基因环境和传播能力，可以为以DNA测序为基础的研究提供可靠的ARGs宿主信息，这对我们深入理解ARGs作为一个新型环境污染物的环境行为，并在此基础上对其采取有效措施加以控制有很大帮助。因此本研究首先测定了不同施肥条件下土壤ARGs的种类和丰度，在此基础上选择ARGs丰度高的土壤筛选抗生素抗性细菌，并对抗性细菌进行基因组扫描分析，以研究土壤中ARGs的种类和宿主。
1 实验内容
1.1研究目标
表征不同施肥条件下土壤ARGs的组成和丰度以及抗生素抗性细菌中ARGs的组成。
1.1.1研究内容
（1）土壤ARGs荧光定量：通过实时定量PCR（qPCR）监测土壤中ARGs和MGEs以及16S rRNA基因。
（2）抗性细菌筛选和鉴定：从祁阳土壤站采集施用猪粪的土壤，采用平板法从土壤中筛选纯化出抗生素抗性细菌。提取抗性细菌总DNA，扩增16S rRNA全长基因测序，进行抗性细菌的种属鉴定。
（3）抗性细菌基因组草图测序及ARGs分析：挑选适当的抗性细菌，将其DNA进行基因组草图测序，分析其ARGs的组成。
1.1.2拟解决的关键问题
本研究将重点对不同施肥条件下土壤中ARGs进行荧光定量，并从ARGs含量高的土壤中筛选抗性细菌用于基因组草图序列以获得抗性细菌中ARGs的组成情况。
1.2材料与方法
1.2.1实验材料
材料：SYBR Green Master Mix，27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)/1492R（GGWTACCTTGTTACGACTT）通用引物，无菌水，TEbuff缓冲液，溶菌酶，蛋白酶K，10%SDS缓冲液，5 M NaCl溶液，CTAB溶液，氯仿/异戊醇（24：1），酚/氯仿/ 异戊醇（25：24：1），异丙醇，70%乙醇，无菌水，PCR管：1.5、2.0、50 ml的离心管，高压灭菌锅，离心机，无菌超净台，BioRad CFX96实时荧光定量PCR仪。
1.2.2实验方法
1.2.2.1土壤的采集及DNA的提取

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