亚铁氧化酶基因的表达调控研究【字数：11510】
输[1]，以Fe2+的形式向木质部中装载，但参与其中亚铁氧化过程的基因缺失。本课题组前期从拟南芥多铜氧化酶家族中筛选到的两个新的亚铁氧化酶基因AtFox1和AtFox2，其表达调控模式仍不清楚。针对这一问题，本文利用荧光定量PCR技术测定了这两个基因在拟南芥不同发育阶段各组织器官中的表达强度，同时研究了缺铁和过量铁胁迫对两者表达的调控。结果发现AtFox1在拟南芥苗期根部的表达量要远高于地上部，而AtFox2在根部的表达量为地上部分的2倍左右。AtFox1和AtFox2在成熟拟南芥的根、叶、茎、花和果荚中均有表达，其中AtFox1在茎和果荚中的表达量最高而AtFox2在果荚中的表达量最高。在上述所有组织中AtFox1的表达量均要高于AtFox2，在根和茎中尤为明显且AtFox1和AtFox2的表达不受缺铁和过量铁胁迫的调控。关键字铁；亚铁氧化酶；拟南芥；荧光定量；表达调控Study on the expression and regulation of ferrous oxidase geneStudent majoring in Environmental Science MAO Min Tutor WANG PengAbstract: Iron is essential for plant growth and development, but iron is less effective in soil under natural conditions, resulting in a general iron deficiency in plants. Iron deficiency can reduce the yield and nutritional quality of crops, which in turn affects human health. Therefore, it is necessary to further improve the mechanism of iron absorption, transport and regulation in plants. Current studies have shown that in the mechanism type I plants, iron absorbed from the root system is mainly transported in the xylem in the form of Fe3+-citrate complex[1], loaded into the xylem in the form of Fe2+, but the genes involved in the oxidation of ferrous iron are missing. The two new ferrous oxidase genes AtFox1 and AtFox2, which were screened from the Arabidopsis thaliana oxidase family, were still unclear. To solve this problem, the expression of these two genes in different tissues and organs of Arabidopsis thaliana was determined by real-time PCR and the regulation of iron deficiency and excessive iron stress on the expression of both were studied. It was found that the expression level of AtFox1 in the roots of Arabidopsis seedlings was much higher than that in the shoots and the expression level of AtFox2 in the roots was about 2 times that of the aerial parts. AtFox1 and AtFox2 were expressed in roots, leaves, stems, flowers and pods of mature Arabidopsis thaliana. Among them, AtFox1 was mostly expressed in the stem and pod, and AtFox2 was expressed highestly in pod. The expression of AtFox1 was higher in all tissues than AtFox2, especially in roots and stems, and the expression of AtFox1 and AtFox2 was not regulated by iron deficiency and excessive iron stress.1 绪论1.1 铁的生物学意义铁是地球上含量较为丰富的金属元素，也是生命的必要组成元素。尽管地质丰度较高，铁依然是生物生长重要的环境限制因素，这是由于铁会与氧气形成高度不溶的氧化物，不易被生物吸收。作为回应，生物进化出各种机制来从环境中获取足够的铁。例如微生物通过分泌铁载体与铁形成螯合物增加其生物可利用性；酵母可以将不溶性三价铁还原成可溶性的亚铁。高等生物也进化出了类似的机制。1.1.1 铁对人体的重要性铁几乎在人体内的所有组织中均有分布，其中65%以血红蛋白的形式存在于红细胞中[2]；15%~20%作为储备铁以铁蛋白或铁血黄素的形式存在于脾、肝、肠、骨髓等组织器官中，供机体缺铁时调用；10%以肌红蛋白和酶的形式存在于肌肉中，还有少量铁与血浆中的运铁蛋白相结合，在血浆中运输。铁作为血红蛋白的重要组成部分，参与氧气的运输和储存，同时也维持着人体的正常造血功能。铁还与很多金属酶的合成与活性息息相关[3]，例如它参与过氧化氢酶、过氧化物酶和细胞色素氧化酶等酶的合成，并且与细胞色素C还原酶、琥珀酸脱氢酶以及乙酰辅酶A等酶的活性密切相关。细胞色素也是以铁-卟啉复合体为辅基的血红素蛋白，可以通过其中Fe2+与Fe3+的价态变化来传递电子，在能量代谢和细胞呼吸中起着非常重要的作用。此外铁还可使人体内吞噬细胞、中性白细胞和外周淋巴细胞保持正常功能，维持人体正常的免疫功能。不同于维生素、蛋白质、脂肪等其他营养物质，铁在人体内可被反复利用。一般成人在体内的铁储存约为1~3 g。通过皮肤和粘膜表面（包括胃肠道内层）细胞的脱落，人体每天会损失大约1 mg的铁。故健康的成年人理论上每天只需要吸收1 mg以上的铁即可满足机体所需。但由于铁吸收效率较低以及膳食摄入不足等原因，全世界有20%~50%左右的人有不同程度的铁缺乏，在发展中国家尤为普遍。铁缺乏会影响肌红蛋白和血红蛋白的合成，还会使组织呼吸、生物氧化以及神经递质的合成与分解相关酶的活性降低，从而导致机体免疫力低下、体温调节能力、神经机能紊乱，智力降低和抗感染能力变弱、工作效率降低等各种疾病[4]，最常见的疾病是缺铁性贫血，影响着全球超过30%的人口，其中妇女和儿童的缺铁性贫血问题尤为突出。在我国孕妇贫血率平均为30%左右，7岁以下儿童贫血率平均为51.6%[5]。1.1.2 铁对植物的重要性铁在植物体内占干重的0.3%左右，主要分布在叶绿体中。铁作为氧化还原金属，参与植物呼吸作用中电子的传递和植物体内活性氧的产生与消除。作为多种酶或辅基的组成部分，铁是植物合成叶绿素和进行光合作用的必需物质。此外铁作为血红蛋白的重要组成部分，在抵御胁迫及植物固氮中具有不可或缺的作用。因此植物体内缺铁会影响到碳水化合物的形成和光合作用的顺利进行，导致呼吸强度降低、抗病力下降，还会影响植物体对氮、磷的吸收利用。植物自身不能生产铁，只能从生长的环境条件中获取铁以满足正常的生长发育。由于在有氧环境中，土壤中铁的溶解性很低，植物可以吸收利用的铁很少，因而铁已成为植物正常生长发育的第三大限制性营养元素。1.2 植物对铁的吸收和转运机制1.2.1 植物对铁的吸收机制虽然地壳中铁含量较为丰富，位列第四，但铁属于过渡金属，非常容易发生电子的得失从而表现出相对稳定的价态。特别是在高pH的钙质土壤中，铁的生物有效性很低，然而植物只有在10-9-10-4 mol/L的铁浓度下才能正常生长[6]。为此，植物在长期进化的过程中形成了两种截然不同的高效铁吸收机制，即还原机制（策略一）和螯合机制（策略二）。除了禾本科植物之外的所有高等植物都使用策略一，主要包含两方面根表面铁螯合物的还原和所产生的亚铁离子穿过根质膜的吸收。在20世纪90年代人们从拟南芥中克隆出了铁螯合还原酶基因FRO2 (ferric-chelate reductase 2) [7-9]和铁调节的转运蛋白基因IRT1 (iron-regulated transporter 1)[10-12]并用来成功解释了策略一的铁吸收过程。从那以后，FRO2和IRT1的同源基因不断从各种植物中被克隆出来。策略一中涉及的其他过程包括从根部到根际的质子和酚类化合物的外排，这有助于增加铁离子的溶解度或保持铁在根表面的还原能力。人们找到大量缺铁条件下诱导的H+-ATPase基因，如黄瓜CsHA1和拟南芥AHA2，这些基因负责质子的外排。此外，缺铁时植物根系也会发生形态变化，如出现转移细胞和额外的根毛来增加根部对铁的吸收。禾本科植物主要采用策略二来进行铁吸收，其过程依赖于麦根酸(mugineic acid, MA)[13]的生物合成和分泌。此途径包括由烟酰胺合成酶(nicotianamine synthase,NAS)介导的三个连续的酶促反应，从烟酰胺转氨酶(nicotianamine aminotransferase,NAAT)经双脱氧麦根酸合成酶(2′-deoxymugeneic acid aynthase,DMAS)到最后产生2-脱氧麦根酸(2′-deoxymugineic acid,DMA)[14-16]—MA的前体。MA合成后一般由TOM1(transporter of mugineic acid family phytosiderophores 1)蛋白分泌至土壤中[17]，根系周围环境中的Fe3+与生成的MA形成螯合物后再由YS1(yellow-stripe 1)和YSL(yellow-stripe 1 like)转运体吸收至细胞内，根据需要再释放出Fe3+供代谢利用。然而也存在一些特殊的植物兼具策略一和策略二的铁吸收机制，例如水稻除了能通过OsYSL15转运蛋白吸收Fe3+-DMA外，还能通过OsIRT1直接吸收Fe2+。但是与策略一植物相比，水稻在根表面仅有非常低的铁螯合物还原酶活性，表明在进化过程中它已经逐渐适应了直接吸收Fe2+，尤其在长时间处于淹水的生长过程时，Fe2+的摄取较Fe3+更为方便。1.2.2 植物对铁的转运机制 由于铁在植物体内的溶解度也很低，所以植物体内必需有合适的螯合剂来负责铁的转运，包括穿过根组织的径向运输、木质部装载，运输和卸载、木质部到韧皮部的转移、韧皮部装载，运输和卸载、向组织和器官的共质体运输和来自源器官或衰老组织的重新分配等。生理学和分子生物学研究表明植物体内有一些重要的螯合剂，如柠檬酸盐[18-19]，烟酰胺(nicotianamin,NA)和MAs [20-21]等。长期以来人们一直认为柠檬酸盐在木质部汁液中铁的螯合和运输中起主导作用。Rellán-Álvarez也鉴定出番茄木质部汁液中的铁实际的转运形式确为Fe3+-柠檬酸盐络合物。AtFRD3 (ferric reductase defective 3)属于拟南芥MATE (multidrug and toxin efflux)家族，编码柠檬酸转运体，能促进柠檬酸外排至木质部。拟南芥frd3突变体表现出叶片缺铁萎黄症状。可能的原因是FRD3转运蛋白的突变导致铁无法被正常转运至木质部而在根的中央维管束中积累，造成叶片中的铁含量显著下降，这进一步表明柠檬酸盐在木质部铁的运输中起主导作用。水稻中的FRD3同源基因OsFRDL1也在根部中柱鞘细胞中特异性表达，然而与拟南芥frd3突变体的严重缺铁的表型相比，OsFRDL1基因敲除植物仅表现出轻微的缺铁症状，表明水稻还具有其他替代的木质部铁转运螯合剂[22]。除了柠檬酸外，植物还会分泌一些酚类物质如咖啡酸(caffeic acid,CA)和原儿茶酸(protocatechuic acid,PCA)等螯合Fe3+，来提高Fe3+的溶解度并进一步将其还原成Fe2+，使质外体中的沉积铁再活化供植物吸收利用。已有研究表明，水稻OsPEZ1(phenolics efflux zero 1)基因突变后，木质部中的CA和PCA的含量都有显著性的降低，而铁却在根部质外体中大量沉积了，说明OsPEZ1负责将PCA转运至木质部，以便质外体中的沉积铁的再利用[23]。铁进入根部共质体后会与相应的螯合剂结合成螯合物，再从共质体中流出进入到质外体中，接着被转运至木质部。FRDL1、FRD3和PEZ1被认为是负责将铁螯合物运输到木质部的，但铁相关的流出机制迄今为止还未明确。目前发现最有可能行使该功能的是拟南芥AtFPN1(ferroportin 1) 或AtIREG1(iron regulated 1) [24]外运体，它是哺乳动物铁流出转运蛋白的同源物，其在肠中铁的吸收和巨噬细胞中铁的再循环中起作用。虽然尚未有明确报道来证实AtFPN1的转运活性，但它定位于质膜，在根部中柱中表达，其功能丧失的突变体在富铁和缺铁培养基中都仅有较少的叶绿素，表明其可能在铁转运中起到重要作用。铁进入木质部后除了被向上运输至植物各细胞外，还可以通过木质部转运到韧皮部，YSL家族的成员广泛参与铁的这一转运过程。YSL家族的创始成员，玉米ZmYS1 [25]促进Fe3+-DMA从根际吸收，在根和芽中响应铁缺乏。此外，YSL家族成员也存在于一些不合成MAs的植物中，通常认为这些非酶性YSL转运蛋白参与了与NA螯合的金属的转运。NA是MAs的前体也是结构类似物，它能螯合各种金属并且所有植物都可以合成，与禾本科植物特异性合成MAs相反。在拟南芥中，AtYSL1和AtYSL3负责铁和其他金属元素与NA螯合物的转运[26-28]，AtYSL2定位在质膜上，还参与金属的横向运输。水稻基因组中一共有18个YSL家族成员[29]。其中，OsYSL2负责与NA螯合的铁和锰的长途运输和组织间的分配。运输Fe3+-DMA的OsYSL15被认为是铁的根部吸收、内部长距离运输和幼苗生长的重要原因。在缺铁情况下突变体osysl15与野生型相比，铁离子在地上部、根部中的积累量较少，表现出明显的萎黄表型；而超表达OsYSL15后，水稻种子和叶片中铁离子的含量则显著上升。另一种Fe3+-DMA转运蛋白基因OsYSL18，属于YSL家族的禾本科特定分支，在植物特定的部位表达，包括生殖组织（特别是花粉和花粉管）和层状关节的韧皮部，表明其在生殖发育和韧皮部铁转运中起到了重要作用[30]。类似于OsYSL15，TOM1和亚铁转运蛋白OsIRT1也在维管束组织中表达，表明这些转运体不仅参与到铁的吸收还参与了铁在植物体内的转运。Nozoye等人还鉴定了两个水稻尼克酰胺外排蛋白ENA1(efflux transporter of nicotianamine 1)和ENA2[17]，它们也可能参与植物体内NA的转运。1.3 亚铁氧化酶的研究进展虽然有关植物亚铁氧化酶的研究非常少，但在其他生物包括哺乳动物、昆虫、酵母以及藻类中，关于亚铁氧化酶在铁吸收和转运中的功能已经有了较为详尽的研究。1.3.1 亚铁氧化酶在哺乳动物、昆虫、酵母以及藻类中的研究Fe2+与Fe3+两种氧化态之间的转化是铁代谢的关键方面，因为两种形式的铁具有不同的性质二价铁在大多数生理条件下是可溶的，但它会促进自由基的形成，而三价铁不促进自由基的形成，但在大多条件下它是高度不溶的。在哺乳动物和昆虫中，亚铁氧化酶分别参与血液和血淋巴中铁的转运过程。在人体肠细胞中，从食物中吸收的铁被细胞膜上的Fpn1蛋白以Fe2+的形式排出肠细胞，之后由细胞膜外侧的铁转运辅助蛋白(Hephaestin,Hp)氧化成Fe3+，并与血液中的转铁蛋白(Transferrin,Tf)特异性结合后被运输到其他的组织器官中[31]。Hp功能降低导致铁在肠道细胞中积累增加，而在机体其它部分不足。在肾脏中，铁的氧化是由血液中溶解态的血浆铜蓝蛋白(Ceruloplasmin,Cp)完成的。胎盘铁转运蛋白(Zyklopen)则负责胎盘中Fe2+的氧化及铁从母体到胎儿的转运。果蝇MCO1基因发挥着类似Hp蛋白的作用，负责将消化系统血淋巴中的Fe2+氧化为Fe3+并由转铁蛋白运输到其他部位，MCO1功能弱化会导致果蝇体内铁含量降低[32]。酵母和藻类中的铁氧化酶在铁的摄取中起作用，通过将二价铁氧化成三价铁，然后通过三价铁通透酶运输进入细胞。酿酒酵母FET3p是该类亚铁氧化酶的典型代表，FET3p在细胞膜上与铁离子通透酶FTR1p组成铁吸收复合体，该复合体对铁有着很高的亲和性，在低铁条件下由FET3p将Fe2+氧化为Fe3+并通过FTR1p进入细胞内[33]。在衣藻中亚铁氧化酶FOX1发挥着与FET3p类似的功能，与铁离子通透酶FTR1共同作用参与缺铁条件下铁的吸收[34]。1.3.2 亚铁氧化酶在植物中的研究进展目前已经被报道的亚铁氧化酶均属于多铜氧化酶家族(Multicopper oxidases, MCOs)[35]。MCOs是一类含铜的氧化还原酶，需要铜离子作为辅助因子，铜的缺乏会抑制MCOs的活性，进而干扰铁代谢，该现象在哺乳动物、昆虫、酵母以及藻类中均有被观察到[36]。研究发现拟南芥铜缺乏同样会干扰其铁代谢，抑制铁向地上部分的转运，拟南芥spl7突变体在铜缺乏时体内亚铁氧化酶的活性降低，缺铁响应相关基因的表达上调，铁向地上部分的转运减少，叶片出现明显的缺铁黄化现象，而铁的添加可以明显缓解叶片黄化的现象。拟南芥MCOs家族中已报道了两个亚铁氧化酶基因LPR1和LPR2，但在拟南芥根部两者仅分别在根尖分生组织和侧根原基中表达[37]，不太可能参与铁的转运。1.3.3 亚铁氧化酶在植物铁毒害中的研究进展Fe2+具有很高的反应活性，是一种很强的促氧化剂，Fe2+可以通过Fenton反应产生大量有害的羟基自由基。在铁过量时，植物体内大量游离的Fe2+会干扰活性氧的平衡，造成严重的氧化胁迫[38]。为了应对铁毒害，植物可能进化出多种机制避免体内游离Fe2+的积累，通过亚铁氧化酶将游离的Fe2+氧化为更为稳定的Fe3+可能是其中之一。亚铁氧化酶在氧气的参与下催化Fe2+的氧化，而副产物为H2O，从而避免了活性氧的产生。1.4 实验目的与意义在双子叶和非禾本科植物中，铁以Fe2+的形式通过铁转运蛋白IRT1进入根部后，主要以Fe3+-柠檬酸螯合物的形式进行长距离的运输，从木质部到韧皮部，在叶肉细胞等其他组织部位按需要又被还原成Fe2+而加以利用。在拟南芥根部，FRD3和FPN1蛋白分别负责将柠檬酸和铁装载至木质部中。FPN1蛋白以Fe2+的形式将铁装载进木质部中，但木质部中的铁主要是以Fe3+-柠檬酸的形式存在。因此，木质部中铁的转运理论上需要亚铁氧化系统的参与，但相关的植物亚铁氧化酶基因及其作用机制仍不清楚。目前拟南芥MCOs家族中已报道了两个亚铁氧化酶基因LPR1和LPR2，但在拟南芥根部两者仅分别在根尖分生组织和侧根原基中表达，不太可能参与铁的转运。因此，拟南芥MCOs家族中可能存在其他未知的亚铁氧化酶基因参与铁的转运过程。课题组前期从拟南芥多铜氧化酶家族中筛选到两个潜在的亚铁氧化酶基因，两者有可能参与木质部的铁转运过程，但目前其表达调控模式仍不清楚。针对这一问题，本文利用荧光定量PCR技术测定了这两个基因在拟南芥不同发育阶段各组织器官中的表达强度，同时研究了缺铁和过量铁胁迫对两者表达的调控，为进一步解释这两个基因的生物学功能提供基础，以期有助于完善植物铁转运相关的基础理论知识，为作物铁生物强化提供新的基因和理论基础。2 亚铁氧化酶基因AtFox1和AtFox2在植物不同组织器官中的表达研究2.1 实验材料2.1.1 植物材料拟南芥野生型(Columbia)种子2.1.2 试剂RNA提取所使用的试剂盒购于BioTeke公司，是其自主研发的独特产品，原理有别于异硫氰酸胍/酚/氯仿的传统提取方法，克服了后者不能将RNA和其他植物多糖的区分开来的缺点，不仅能高效地将RNA与其他植物多糖分开，同时还能一并有效去除多酚和其他植物次级代谢成分；逆转录试剂HiScript® || Q Select RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)和荧光定量PCR试剂AceQ® qPCR SYBR® Green Master Mix均购于Vazyme公司。2.1.3 实验仪器涡旋仪、金属浴加热仪、常速离心机、高速离心机、冷冻离心机、NanoDrop超微量紫外分光光度计、普通PCR仪、荧光定量PCR仪等2.2 实验方法2.2.1 植物培养用万分之一天平称取2 mg左右拟南芥野生型(Columbia)种子于2 ml离心管中，在植物超净台上用1 ml移液枪分两次在离心管中加入1.5 ml 70%乙醇浸润种子并上下缓慢颠倒离心管，并于1 min之内取出乙醇后用灭菌蒸馏水重复清洗一次，再用8% (v/v) NaClO重复清洗一次，计时5 min，期间上下缓慢颠倒离心管，进行种子表面消毒后，再用灭菌蒸馏水浸洗六次后用灭菌枪头点种到1/2 MS固体培养基（2%蔗糖，1% agar，pH5.8 ，121℃灭菌20 min）上，点种时种子间距适宜，以便给植物留下充分的生长空间。点种完毕后，利用超净台无菌风将培养基上多余的水分吹干，之后用封口膜将培养基封口后侧立在培养架上放置在4℃冰箱待春化萌发出现2片真叶后（约一周时间），随机挑选大小一致、生长状况良好的幼苗用镊子轻轻夹取转移到盛有1/2 Hoaglands’营养液的培养盆中进行水培，将幼苗的根浸在营养液中，用海绵固定。在移苗过程中要确保拟南芥根部浸润到营养液中，且整个过程尽可能缩短时间，避免部分苗由于湿度不够而萎蔫枯死。水培初期，需在培养盆上覆盖保鲜膜以维持一定湿度并约6 d换一次营养液，后期敞口并约4 d换一次营养液。1/2 Hoagland营养液的成分为1 M KNO3(3 ml/L)、1 M NH4H2PO4(1 ml/L)、1 M MgSO4·7H2O(0.5 ml/L)、1 M Ca(NO3)2·4H2O(2 ml/L)、20 mM Na2-EDTA·2H2O(1 ml/L)、25 mM H3BO3(0.1 ml/L)、20 mM FeSO4·7H2O(1 ml/L)、2 mM ZnSO4·7H2O(0.1 ml/L)、2 mM MnSO4·4H2O(0.1 ml/L)、0.1 mM (NH4)6Mo7O24·4H2O(0.1 ml/L)、0.1 mM CuSO4·5H2O(0.1 ml/L)和1 mM KCl(0.1 ml/L)和0.5 g/L MES，用0.1 M NaOH或0.1 M HCl调节pH值至5.5 ± 0.3。2.2.2 植物采样实验需要在拟南芥不同生长时期、不同生长部位包括苗期的根和地上部分和成熟期拟南芥的莲座叶、茎生叶、花、果荚、茎、根部进行采样，每个样品需取四组平行。在采样时尽可能挑选长势较好无明显不良症状的植株，此外平行样间，尽可能保证生物量的差异较小。在取苗期地上地下部样品时，地上部完整取为一个样，而地下部即根，由于生物量较小通常取两株地下部分合并为一个样品。在取成熟期样品时，对于果荚、花这类生物量较小的部位，常选取多簇为一个样，但要尽可能减小平行样间的差异同时单个样品的生物量也不能高于100 mg，以避免为后续样品的处理造成麻烦。所取植物鲜样均放在提前做好标签放置钢珠并打有小孔的2.0 ml离心管中并于液氮中冻干后转移至-80℃冰箱以待进一步处理，在采样时动作需迅速，以免植株在离开原有生存环境后自身开始核酸降解。2.2.3 植物总RNA提取总RNA提取所用的离心管和枪头均用双层报纸包裹并于121℃灭菌40 min。采用柱式提取法提取所采拟南芥不同组织部位样品的总RNA，具体步骤如下（1）将之前保存在-80℃冰箱中的植物样用液氮盛放取出，放入冷冻离心机中于50 Hz下离心60 s后迅速取出离心管小心开盖后放置于冰上（提前准备好冰盒），再快速往离心管中各加1 ml的裂解液PL后涡旋混匀（裂解液PL提前于65℃中预热）。（2）将混匀后的样品转移至金属浴加热仪中，于65°C条件下孵育5 min，期间将离心管轻轻上下颠倒一到两次，目的是使核蛋白体充分分解。（3）将孵育好的样品转移至高速离心机中，在室温12,000 rpm条件下离心10 min，期间准备好RNase-free过滤柱和RNase-free吸附柱，并做好相应的标签。待常温离心结束后，用移液枪小心将上清液（约850 μL）转入事先准备好的RNase-free过滤柱中再次于高速离心机中在4℃，10,000 rpm条件下离心60 s。此时总RNA存在于下滤液中。（4）将过滤柱取出，在收集管中加入1倍体积的70%乙醇，上下颠倒混匀。将得到的溶液和可能的沉淀一起转入事先准备好的RNase-free吸附柱RA中，由于吸附柱RA最多只能容纳700 μl的溶液，故需要分两次过柱。（5）将吸附柱于高速离心机中在4℃，10,000 rpm条件下离心60 s后弃掉下滤液，再将吸附柱重新套回收集管。（6）待所有样品全部完成步骤（5）后，往吸附柱RA中加入500 μL漂洗液RW，于高速离心机中在4℃，12,000 rpm的条件下离心60 s后弃掉下滤液。（7）将吸附柱RA放回空收集管中，于高速离心机中在4℃，12,000 rpm条件下再离心2 min，弃掉下滤液，目的是尽可能的除去漂洗液RW，以免漂洗液中残留的乙醇抑制酶消化反应。（8）在吸附柱中加入500 μL去蛋白液RE，室温放置反应2 min，于高速离心机中在4℃，12000 rpm条件下离心60 s后弃掉下滤液。（9）在离心管中加入500 μL漂洗液RW，于高速离心机中在4℃，12,000 rpm条件下离心60 s，弃掉下滤液。（10）重复步骤（9）一次。（11）将吸附柱RA放回空收集管中，于高速离心机中在4℃，12,000 rpm条件下再离心2 min，弃掉下滤液，尽可能的除去漂洗液RW，以免漂洗液中残留的乙醇抑制酶消化反应。（12）取出吸附柱RA，放入事先灭好菌并做好标签的1.5 ml RNase-free离心管中，在吸附膜的中间部位加60 μL RNase-free water（事先在65℃下预热），室温放置两分钟，于高速离心机中在4℃，12,000 rpm的条件下离心60 s后迅速转移置冰上。（13）用超微量紫外分光光度计NanoDrop测定所提样品的总RNA浓度及纯度后，放置于-80℃超低温冰箱保存以备后续使用。2.2.4 反转录合成第一链cDNA以所提植株各部位总RNA为模板，反转录酶与引物Oligo(dT)23VN引导cDNA第一链的合成。在0.2 mL离心管中依次加入总RNA（事先按20 μL体系确保总量低于1 μg计算好）、Oligo(dT)23VN 1 μL、4x gDNA wiper Mix 4 μL、最后加RNase-free ddH2O补足16 μL体系，用移液器轻轻吹打混匀后将离心管于普通PCR仪中42°C反应2 min，反应结束后迅速置于冰上冷却，微离心将溶液甩至离心管底部，再加入5x HiScript || Select qPCR SuperMix || 4 μL，用移液枪吸打混匀并微离心后，于普通PCR仪上50°C反应15 min，85°C反应5 s后取出，转移至-20°C低温冰箱中保存备用。2.2.5 荧光定量PCR反应实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。本实验所使用的荧光染料是SYBR Green I。SYBR Green I是一种具有绿色激发波长的染料，能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域。SYBR Green I在游离状态下只发出微弱的荧光，与DNA结合后荧光强度放大，可被仪器检测到。在PCR反应体系中，加入过量的SYBR荧光染料后，SYBR荧光染料会非特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR Green I发出的荧光信号不能被仪器所捕捉到，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加是完全同步的，因此，可以根据荧光信号来检测PCR体系中双链DNA的数量。将反转后的cDNA模板稀释10倍（参考稀释度），使与cDNA浓度对应的Ct值在15-35之间，以保证最终结果具有一定的可信度。qPCR的反应体系如下2x AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 µL Primer1(10 µM) 0.4 µLPrimer2(10 µM) 0.4 µL 稀释过后的cDNA 5.0 µL ddH2O 3.8 µL 20 µL由于DNA模板的量对最终的结果有较大的的影响，为了减小加样时的误差，故在配置体系时选择将2x AceQ qPCR SYBR Green Master Mix、稀释过后的cDNA和ddH2O混合在一起配成一个mix后加样于定量96孔板中，再加入相应的引物。待所有孔加样完成后小心贴上配套使用的贴膜将孔板封口后于离心机中轻微离心后放置于荧光定量PCR仪中进行定量。荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性5 min后，用两步法进行扩增，即95°C变性10 s，60°C退火和延伸30 s，共40个循环，PCR扩增结束后做60~95°C的熔解曲线。所有样qPCR时设置两个技术重复。 2.3 结果2.3.1 RNA提取结果所提样品RNA的OD260与OD280的比值均在1.8-2.2的范围内，表明所提取的总RNA质量良好，可用于后续反转录反应。表1 拟南芥苗期地上地下部分和成熟期各组织部位的RNA浓度Table 1 RNA concentration in the shoot and root of Arabidopsis at seeding stage and in different tissues at maturity stage样品浓度（ ng/µL）样品浓度（ ng/µL）地上部分504果荚96.16552.96101.6458.488.08545.6865.92地下部分179.68花251.52158.4230.32207.76274.32429.28293.28莲座叶391.2根165.68573.1248.24316.96117.84320152.56茎生叶374.96茎46.72235.9244.48369.5257.6191.0429.362.3.2 AtFox1和AtFox2在拟南芥苗期的表达从图1中我们可以明显看出，在拟南芥苗期，AtFox1基因在地下部分的表达量约为地上部分表达量的11倍，AtFox2基因在地下部分的表达量约为地上部分的2倍，且无论在地上部分还是地下部分AtFox1基因的表达量都显著高于AtFox2基因的表达量。/ 图1 AtFox1和AtFox2在拟南芥苗期地上部分和地下部分的表达 Figure 1 Expression of AtFox1 and AtFox2 in the shoot and root of Arabidopsis at seedling stage2.3.3 AtFox1和AtFox2在拟南芥成熟期各器官中的表达从图2中我们可以看出AtFox1基因和AtFox2基因在拟南芥成熟期各组织部位均有一定量的表达且无论在哪一组织部位都是AtFox1基因较AtFox2基因表达量高。对于AtFox1基因而言，在茎和果荚中的表达量较多，而在花、根、茎生叶、莲座叶中的表达量较低。对于AtFox2而言，在果荚中的表达量较高，而在花、茎生叶、根、茎、莲座叶的表达量较低。/图2 AtFox1和AtFox2在拟南芥成熟期不同组织部位的表达 Figure 2 Expression of AtFox1 and AtFox2 in different tissues of Arabidopsis at maturity stage2.4 讨论从时间上来分析，在拟南芥苗期时AtFox1和AtFox2这两个基因在地下部分即根部的表达量是远大于地上部分的，但当拟南芥处于成熟期各组织出现明显分化时，这两种基因在根部并没有显现出较高的表达量，且与根部相邻的莲座叶中这两种基因的表达量也较低，反而在茎和果荚中出现了较高的表达量。由此我们可以推断当拟南芥从营养生长转入生殖生长阶段后，由于体内对铁需求的重新分配从而导致这两种基因在不同部位选择性表达的程度发上了改变。此外在实验前，我们推断木质部中的铁的转运是需要亚铁氧化酶系统的参与的，将Fe2+氧化以Fe3+-柠檬酸的形式参与体内的运输。在植物的生长发育过程中，木质部也由原生、后生向次生发展，逐渐完善植物体内的运输网络，这与实验结果中从苗期时这两种基因绝大多数都在根部表达而生长后期两种基因却在果荚和花等组织中也有一定量表达的结果相符合。从空间上来分析，除了在果荚中AtFox1和AtFox2这两个基因的表达量相当、在茎中AtFox1的表达量远高于AtFox2的表达量以外，在莲座叶、茎生叶、花、根中AtFoX1的表达量均是AtFox2的两到三倍左右。由此可以推断出在除果荚外的植物组织中AtFox1基因在亚铁氧化过程中起主要作用而AtFox2起辅助作用，而在果荚中这两种基因的表达量都较高，可能除了亚铁氧化作用外还与植物的其他生殖过程有关，但是在数据处理的过程中发现果荚组的数据误差棒较大，因而给结论带来了很大的不确定性。3 亚铁氧化酶基因AtFox1和AtFox2在不同铁处理浓度下的表达调控研究3.1 材料与方法3.1.1 植物材料拟南芥野生型(Columbia)种子3.1.2 试剂 RNA提取试剂盒、反转录试剂、荧光定量PCR试剂（见2.1.2）3.1.3 实验仪器涡旋仪、金属浴加热仪、常速离心机、高速离心机、冷冻离心机、NanoDrop超微量紫外分光光度计、普通PCR仪、荧光定量PCR仪等3.2 实验方法3.2.1 植物培养拟南芥常规水培（见2.2.1）3.2.2 植物铁处理幼苗水培20 d后进行铁处理，本实验共设有三个铁处理浓度，分别为0 mM、20 mM和200 mM。铁以Fe(Na)EDTA的形式加入到营养液中。对于0 mM处理组，由于在处理前20 d的正常水培过程中，原营养液中就存在20 mM的Fe(Na)EDTA，故在进行缺铁处理前需要用5 mM CaSO4溶液浸泡根部5 min，再用清水浸泡根部5 min，并重复清水浸泡根部两次以洗去残留的CaSO4溶液，此做法是利用阳离子交换原理尽可能除去在之前正常水培期间拟南芥根部外侧吸附的铁离子，以便在之后的缺铁培养中，植物能真正的处于一个缺铁的外部环境中；对于20 mM处理组，沿用原培养液培养即可；对于200 mM的高铁处理组则需要在原有营养液中加入额外的Fe(Na)EDTA以提高铁浓度。3.2.3 植物采样不同处理组植株加处理后即开始计时，并分别于0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h进行植物根的采样，每个处理组每个采样时间均需取三组平行样，放置于事先准备好的离心管中，用液氮快速冷冻后放置-80°C超低温冰箱保存，以备后续实验使用。3.2.4 植物总RNA提取采用BioTeke公司的RNA提取试剂盒，采用柱式提取法提取植物样总RNA，具体操作（见2.2.3）3.2.5 反转录合成第一链cDNA以所提植株各部位总RNA为模板，反转录酶与引物Oligo(dT)23VN引导cDNA第一链的合成。具体体系及操作步骤（见2.2.4）3.2.6 荧光定量PCR将反转后的cDNA模板稀释10倍（参考稀释度），配置如下体系2x AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 µL Primer1(10 µM) 0.4 µLPrimer2(10 µM) 0.4 µL 稀释过后的cDNA 5.0 µL ddH2O 3.8 µL 20 µL具体操作步骤及反应程序（见2.2.5）3.2.7 数据统计方法利用Microsoft Excel和SPSS (p<0.05)进行统计数据，计算均值和标准差等，并进行显著性分析，绘制柱状图。3.3 结果3.3.1 RNA提取结果样品RNA的OD260与OD280的比值在1.8-2.2范围内，表明所提取的总RNA质量良好，可用于后续反转录反应。表2 不同处理组在不同处理时间下拟南芥根部RNA浓度Table 2 RNA concentration in the root of Arabidopsis in different treatment groups at different processing time样品浓度（ng/µL）样品浓度（ng/µL）样品浓度（ng/µL）0 h +Fe526.886 h CK777.1224 h -Fe759.36503.92164.56299.36161.12332.64557.920 h Ck720.326 h -Fe647.3648 h +Fe422.0869.04267.28792.8829.12592.64884.480 h -Fe507.3612 h +Fe430.5648 h CK882.4294.24192.08539.28900.24570.0459.043 h +Fe262.4812 h CK178.448 h -Fe759.6215.28590.16453.28355.2102.561139.283 h CK323.8412 h -Fe754.872 h +Fe147.12524.72577.68589.12/544.32490.643 h -Fe497.0424 h +Fe/72 h CK460.24669.36720.4445.36590.48414.96646.566 h +Fe418.6424 h CK619.9272 h -Fe995.44527.52702.4911.28478.24626.32624.483.3.2 在过量铁和缺铁条件下AtFox1在拟南芥根部的表达量分析结合图3，我们可以看出除了6 h的-Fe组与对照组有显著性差异外，其他处理组均无显著性差异且AtFox1在不同时刻的表达量相差较小，绝大部分都在1~2.5之间。/图3 在过量铁和缺铁条件下AtFox1在拟南芥根部的表达量Figure 3 Expression of AtFox1 in the root of Arabidopsis under the condition of excessive iron and iron deficiency3.3.3 在过量铁和缺铁条件下AtFox2在拟南芥根部的表达量分析结合图4，我们可以看出除了6 h的-Fe组与对照组有显著性差异外，其他处理组均无显著性差异且0 h~6 h之间AtFox2的表达量远低于6 h~72 h的表达量。/图4 在过量铁和缺铁条件下AtFox2在拟南芥根部的表达量Figure 4 Expression of AtFox2 in the root of Arabidopsis under the condition of excessive iron and iron deficiency3.4 讨论在探究外界铁浓度对AtFox1和AtFox2基因表达调控的研究中，我们设置了缺铁(0 mM)、正常对照(20 mM)和高铁(200 mM)三个浓度梯度，并于0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h进行了拟南芥地上和地下部分的采样，但从前期AtFox1和AtFox2这两个基因在拟南芥苗期地上部和地下部分的表达量结果来看，这两个基因在地上部分的表达量均不高，因此在这次研究外界铁浓度对这两个基因的表达调控实验中，我们仅对地下部分即根部进行研究。从整体结果来看，我们可以发现与先前实验结论一致，在苗期拟南芥根部AtFox1基因的表达量远高于AtFox2基因。从AtFox1基因和AtFox2基因分别进行的显著性差异分析结果(p<0.05)来看，无论是过量铁处理还是缺铁处理，除个别值外，这两个基因的表达量较对照组而言并没有显著性差异，故我们可以认为AtFox1和AtFox2基因的表达调控可能不受外界铁条件的影响。值得注意的是在整个处理时间中，AtFox1基因的表达量较稳定而AtFox2基因的表达量在前6 h较低且稳定而在后60 h内较高且稳定，造成这样的结果的原因还不清楚。4 结论在双子叶和非禾本科植物中，铁以Fe2+的形式通过铁转运蛋白IRT1进入根部后，主要以Fe3+-柠檬酸螯合物的形式进行长距离的运输，从木质部运输到韧皮部，在叶肉细胞等其他组织里按需要又被还原成Fe2+而加以利用。在拟南芥根部，FRD3和FPN1蛋白分别负责将柠檬酸和铁装载至木质部中。FPN1蛋白以Fe2+的形式将铁装载进木质部中，但木质部中的铁主要是以Fe3+-柠檬酸的形式存在。因此，木质部中铁的转运理论上需要亚铁氧化系统的参与，但相关的植物亚铁氧化酶基因及其作用机制仍不清楚。目前拟南芥MCOs家族中已报道了两个亚铁氧化酶基因LPR1和LPR2，但在拟南芥根部两者仅分别在根尖分生组织和侧根原基中表达，不太可能参与铁的转运。因此，拟南芥MCOs家族中可能存在其他未知的亚铁氧化酶基因参与铁的转运过程。本次实验对前期从拟南芥多铜氧化酶家族中筛选到的两个潜在的亚铁氧化酶基因AtFox1和AtFox2运用荧光定量PCR技术进行了表达调控研究以期进一步了解这两个基因的生理功能。实验得出以下的结论1、在拟南芥苗期AtFox1和AtFox2在地下部分具有较高表达量，且AtFox1的表达量显著高于AtFox2，但在地上部分两者的表达量均比较低。2、在拟南芥成熟期，这两个基因在根部的表达量均较低，而在整个地上部分的表达量与苗期相比有了显著的提高，其中AtFox1基因在果荚和茎中有较高的表达量，而AtFox2基因仅在果荚中有较高表达量。3、在探究外界铁浓度对AtFox1和AtFox2基因表达调控的研究中，我们设置了缺铁(0 mM)、正常对照(20 mM)和高铁(200 mM)三个浓度梯度，并于0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h采样定量分析，通过差异显著性分析后初步认为AtFox1和AtFox2基因的表达调控可能不受外界铁的影响。致谢特别感谢徐仲瑞师兄带领我完成整个毕设，从选题、设计、实验到最后论文的撰写和修订都凝结了师兄大量的心血。也感谢蔡美玲师姐及实验室其他师兄师姐，在我做实验遇到问题时给予了我无私的帮助。 参考文献[1] Kobayashi T, Nishizawa N K. Iron Uptake, Translocation, and Regulation in Higher Plants[J]. Annual Review of Plant Biology, 2012, 63(1): 131-152.Guerinot M L, Yi Y. Iron: Nutritious, Noxious, and Not Readily Available[J]. Plant Physiology, 1994, 104(3): 815-820.Abbaspour N, Hurrell R F, Kelishadi R, et al. Review on iron and its importance for human health[J]. Journal of Research in Medical Sciences, 2014, 19(2): 164-174.Lieu P T, Heiskala M, Peterson P A, et al. The roles of iron in health and disease[J]. Molecular Aspects of Medicine, 2001, 22(1): 1-87.徐素萍. 微量元素铁与人体健康的关系[J]. 中国食物与营养, 2007(12):51-54.Grotz N, Guerinot M L. Molecular aspects of Cu, Fe and Zn homeostasis in plants[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2006, 1763(7): 595-608.Connolly E L, Campbell N H, Grotz N, et al. Overexpression of the FRO2 Ferric Chelate Reductase Confers Tolerance to Growth on Low Iron and Uncovers Posttranscriptional Control[J]. Plant Physiology, 2003, 133(3): 1102-1110.Mukherjee I, Campbell N H, Ash J S, et al. Expression profiling of the Arabidopsis ferric chelate reductase (FRO) gene family reveals differential regulation by iron and copper[J]. Planta, 2006, 223(6): 1178-1190.Robinson N J, Procter C M, Connolly E L, et al. A ferric-chelate reductase for iron uptake from soils[J]. Nature, 1999, 397(6721): 694-697.Eide D J, Broderius M, Fett J P, et al. A novel iron-regulated metal transporter from plants identified by functional expression in yeast[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93(11): 5624-5628. Varotto C, Maiwald D, Pesaresi P, et al. The metal ion transporter IRT1 is necessary for iron homeostasis and efficient photosynthesis in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal, 2002, 31(5): 589-599.Vert G, Grotz N, Dedaldechamp F, et al. IRT1, an Arabidopsis Transporter Essential for Iron Uptake from the Soil and for Plant Growth[J]. The Plant Cell, 2002, 14(6): 1223-1233.Hindt M N, Guerinot M L. Getting a sense for signals: Regulation of the plant iron deficiency response[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2012, 1823(9): 1521-1530.Bashir K, Inoue H, Nagasaka S, et al. Cloning and Characterization of Deoxymugineic Acid Synthase Genes from Graminaceous Plants[J]. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(43): 32395-32402.Takahashi M, Yamaguchi H, Nakanishi H, et al. Cloning Two Genes for Nicotianamine Aminotransferase, a Critical Enzyme in Iron Acquisition (Strategy II) in Graminaceous Plants[J]. Plant Physiology, 1999, 121(3): 947-956. Higuchi K, Suzuki K, Nakanishi H, et al. Cloning of Nicotianamine Synthase Genes, Novel Genes Involved in the Biosynthesis of Phytosiderophores[J]. Plant Physiology, 1999, 119(2): 471-480.Nozoye T, Nagasaka S, Kobayashi T, et al. Phytosiderophore Efflux Transporters Are Crucial for Iron Acquisition in Graminaceous Plants[J]. Journal of Biological Chemistry, 2011, 286(7): 5446-5454.Brown J C, Chaney R L. Effect of Iron on the Transport of Citrate into the Xylem of Soybeans and Tomatoes[J]. Plant Physiology, 1971, 47(6): 836-840. Tiffin L O. Iron Translocation II. Citrate/Iron Ratios in Plant Stem Exudates[J]. Plant Physiology, 1966, 41(3): 515-518.Aoyama T, Kobayashi T, Takahashi M, et al. OsYSL18 is a rice iron(III)–deoxymugineic acid transporter specifically expressed in reproductive organs and phloem of lamina joints[J]. Plant Molecular Biology, 2009, 70(6): 681-692. Kakei Y, Yamaguchi I, Kobayashi T, et al. A Highly Sensitive, Quick and Simple Quantification Method for Nicotianamine and 2′-Deoxymugineic Acid from Minimum Samples Using LC/ESI-TOF-MS Achieves Functional Analysis of These Components in Plants[J]. Plant and Cell Physiology, 2009, 50(11): 1988-1993.Yokosho K, Yamaji N, Ueno D, et al. OsFRDL1 is a citrate transporter required for efficient translocation of iron in rice[J]. Plant Physiology, 2009, 149(1): 297-305.Yoshino M, Murakami K. INTERACTION OF IRON WITH POLYPHENOLIC COMPOUNDS : APPLICATION TO ANTIOXIDANT CHARACTERIZATION[J]. Analytical Biochemistry, 1998, 257(1): 40-44.Ishimaru Y, Kakei Y, Shimo H, et al. A rice phenolic efflux transporter is essential for solubilizing precipitated apoplasmic iron in the plant stele[J]. Journal of Biological Chemistry, 2011, 286(28): 24649-24655.Morrissey J, Baxter I, Lee J, et al. The Ferroportin Metal Efflux Proteins Function in Iron and Cobalt Homeostasis in Arabidopsis[J]. The Plant Cell, 2009, 21(10): 3326-3338.Curie C, Panaviene Z, Loulergue C, et al. Maize yellow stripe1 encodes a membrane protein directly involved in Fe(III) uptake[J]. Nature, 2001, 409(6818): 346-349.Jean M L, Schikora A, Mari S, et al. A loss-of-function mutation in AtYSL1 reveals its role in iron and nicotianamine seed loading[J]. Plant Journal, 2005, 44(5): 769-782.Waters B M, Chu H, Didonato R J, et al. Mutations in Arabidopsis Yellow Stripe-Like1 and Yellow Stripe-Like3 Reveal Their Roles in Metal Ion Homeostasis and Loading of Metal Ions in Seeds[J]. Plant Physiology, 2006, 141(4): 1446-1458.Chu HH, Chiecko J, Punshon T, et al. Successful reproduction requires the function of Arabidopsis Yellow Stripe-Like and Yellow Stripe-Like3 metal-nicotianamine transporters in both vegetative and reproductive structures[J].Plant Physiology, 2010, 154(1): 197-210.Lee S, Chiecko J, Kim S A, et al. Disruption of OsYSL15 Leads to Iron Inefficiency in Rice Plants[J]. Plant Physiology, 2009, 150(2): 786-800.Vashchenko G, Macgillivray R T. Multi-Copper Oxidases and Human Iron Metabolism[J]. Nutrients, 2013, 5(7): 2289-2313.Lang M, Braun C L, Kanost M R, et al. Multicopper oxidase-1 is a ferroxidase essential for iron homeostasis in Drosophila melanogaster[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(33): 13337-13342.Philpott C C, Protchenko O. Response to Iron Deprivation in Saccharomyces cerevisiae[J]. Eukaryotic Cell, 2008, 7(1): 20-27.Terzulli A, Kosman D J. Analysis of the High-Affinity Iron Uptake System at the Chlamydomonas reinhardtii Plasma Membrane[J]. Eukaryotic Cell, 2010, 9(5): 815-826.张志仙,陈起振,曹家树.植物多铜氧化酶及其亚家族成员SKS蛋白[J].中国细胞生物学学报,2011(2)167-172.Bernal M, Casero D, Singh V, et al. Transcriptome sequencing identifies SPL7-regulated copper acquisition genes FRO4/FRO5 and the copper dependence of iron homeostasis in Arabidopsis[J]. The Plant Cell, 2012, 24(2): 738-761.Muller J, Toev T, Heisters M, et al. Iron-Dependent Callose Deposition Adjusts Root Meristem Maintenance to Phosphate Availability[J]. Developmental Cell, 2015, 33(2): 216-230.Mittler R. ROS Are Good[J]. Trends in Plant Science, 2017, 22(1): 11-19.
目录
引言
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/563333.html
最新推荐
热门阅读
