大豆是重要的油料和蛋白质作物，裂荚是野生大豆繁衍后代的一种原始自然属性，但也是导致大豆减产的主要原因之一，所以研究裂荚相关基因的功能对改善大豆产量具有重要意义。Glyma08g42120 是本实验室通过关联分析得到的一个候选基因。本研究对该基因进行了全长克隆，序列分析的结果表明该基因是编码一个α/β水解酶蛋白，组织表达分析结果表明Glyma08g42120在花和荚中表达量较高，且在低裂荚材料中的表达量比在高裂荚材料中的表达量高，亚细胞定位结果显示Glyma08g42120编码的蛋白定位在细胞膜上，单倍型分析发现Glyma08g42120在19种极端材料中35个与裂荚显著相关SNP位点。通过拟南芥过表达Glyma08g42120，发现转基因植株与对照植株在表型上没有显著的差异。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
1 材料与方法 5
1.1 材料 5
1.1.1 研究材料 5
1.1.2 菌株、试剂及材料 5
1.2 方法 5
1.2.1 Glyma08g42120基因cDNA全长的克隆 5
1.2.2 Glyma08g42120进化树和序列分析 6
1.2.3 Glyma08g42120组织表达分析 6
1.2.4亚细胞定位 6
1.2.5 Glyma08g42120在极端材料中表达量分析 6
1.2.6 Glyma08g42120在极端材料中单倍型分析 7
1.2.7 Glyma08g42120转基因拟南芥的获得与鉴定 7
2 结果与分析 8
2.1 Glyma08g42120基因cDNA全长的克隆 8
2.2 Glyma08g42120多序列比对和系统发生分析 8
2.3 Glyma08g42120在大豆组织中的组织表达分析 9
2.4 Glyma08g42120的亚细胞定位 10
2.5 Glyma08g42120在极端材料中的表达量分析 10
2.6 Glyma08g42120在极 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
端材料中单倍型分析 10
2.7 Glyma08g42120转基因拟南芥阳性植株的检测 11
2.8 Glyma08g42120转基因拟南芥的表型分析 12
3 讨论 13
致谢 14
参考文献 14
附录A 大豆RNA提取 15
附录B 大豆DNA提取 15
大豆裂荚相关基因Glyma08g42120的克隆及功能研究
引言
荚果( Pod)是由子房发育而来的果实，由通过背缝线和腹缝线相互连接的 2个单心皮组成，大豆豆荚是荚果的一种。成熟的大豆荚沿着荚的背缝线和腹缝线裂开，并且散出种子的现象称为裂荚(Podshattering)[1]。大豆[Glycine Max（L.）Merr.]原产于中国，是重要的油料和蛋白质作物，属于经济豆科植物。裂荚是野生大豆繁衍后代的一种原始自然属性，同时这也是导致大豆减产的主要原因之一，所以研究裂荚相关基因的功能对改善大豆产量具有重要意义。
豆科植物裂荚的生理机制可归纳为2类：第1类是主动裂荚，即由于荚皮的内生厚壁组织层细胞所产生的张力不同使连接背、腹缝线的薄壁组织拉裂，荚皮开裂，该过程不需借助外力，主要由内置主动机制引导；第2类是被动裂荚或酶调控裂荚，即裂荚区内的细胞壁修饰酶对裂荚区的离层细胞进行裂解，离层细胞彼此分离，夹皮开裂，该过程受外力影响（如酶的水解），内置主动机制并未发挥显著作用（如荚皮不产生拉力）。豆科植物裂荚特性与主动裂荚机制或被动裂荚机制相联系，或两者共同作用导致荚瓣分离使得种子散播[2]。Christiansen 等[3]和 Summers 等[4]则提出，在栽培大豆豆荚的背部和腹部的缝合线处存在类似于十字花科植物开裂区(Dehiscence zone)的类似结构，该结构与大豆抗裂荚能力密切相关,这些相似性为2类植物裂荚的后续研究提供一定的借鉴。
Tsuchiya等[6]用最大似然法对8个大豆杂交品系进行评估，发现裂荚性状是由12个基因控制的，并估算出裂荚性状的平均遗传性为93%。而随着遗传分析方法的建立，数量性状基因座（quantitative trait locus，QTL）定位已成为研究大豆裂荚性状的主流方法。自从Keim[5]首次发表大豆QTL定位结果以来，越来越多的QTL和大豆产量性状基因被相继定位。Bailey等［7］对大豆品种‘Young’和‘PI416937’的120个杂交品系的裂荚性状进行QTL分析，定位到1个主效和多个微效QTL座位，分别位于第2、第15、第16和第19染色体上，并运用限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）标记技术构建了大豆的遗传连锁图谱，这为后来的研究奠定了基础。
Funatsuki等[8]使用复合区间作图法，QTL分析了1个性状分离的大豆重组自交系种群，首次定位到1个控制大豆裂荚性状的主效QTL座位，并确定了该QTL座位位于第16号染色体上，位于简单重复序列（simple sequence repeat ,SSR）标记Sat_093和Sat_366之间，另外估算这2个标记之间的遗传距离为2.9cm，命名为qPDH1。Kang等［9］利用SSR标记对大豆品种‘Keunlkong’和‘Sinpaldalkong’的重组自交体系种群的裂荚性状进行QTL分析，定位到1个主效和3个微效QTL座位。Yamada等［10］分析了几个大豆种群的分子标记，发现不论亲本选用什么品系，杂交F2代的品系中，控制裂荚性状的QTL座位都定位在附近。Suzuki等[11]对qPDH1进一步进行了精细定位将qPDH1限定在大小为134kb的基因组区域，但研究发现在这个区域中没有与拟南芥中裂荚基因同源的候选基因。Luo等[12]以大豆高代重组自交系群体和驯化程度低的农家种‘灰布支’为亲本，对其家系的裂荚性状进行QTL定位，在第6号染色体上检测到1个主效QTL座位，位于SSR标记Satt062和Satt－520之间，命名为qPDH61。此外，他们还在qPDH61座位附近发现了1个具有生长素反应蛋白活性的基因Glyma06g00860.1和1个编码水解酶的基因Glyma06g01500.1，这表明生长素和水解酶在大豆裂荚过程中发挥着重要的作用。Gao等［13］对qPDH1座位进行精细定位，将其定位在第16号染色体上的47kb区域上。同时他们在qPDH1附近发现了1个编码bZIP类转录因子的基因Glyma16g25600，该基因启动子包含1个113bp的碱基插入或缺失，相关研究表明，bZIP类转录因子的剧烈表达，会导致植物细胞次生壁的显著加厚［14］。Funatsuki等[7]通过图位克隆方法克隆到这一基因Pdh1编码一个DIR类蛋白，其抗裂荚等位基因pdh1有一个提前终止的密码子。功能基因Pdh1在荚果内壁厚壁组织富含木质素的区域表达量高，尤其是在在木质素沉积起始阶段，Pdh1通过加强干豆荚壁的扭转程度来促进荚开裂。Dong等[15]进一步研究发现从野生大豆到栽培大豆的驯化过程NAC基因家族SHAT15基因上游4kb处的一个抑制子被彻底清除，使SHAT15在栽培大豆纤维帽细胞中的表达剧烈上调，表达强度较野生大豆提高了15倍，导致其次生壁显著加厚，从而有效阻止了果荚的自然开裂过程。该基因与拟南芥中的NST1/2同源，可以激活次生细胞壁的生物合成，同时促进大豆荚开裂区域荚腹缝线的纤维帽细胞的增厚。

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