大豆是一种重要的蛋白质来源，是人类生活中重要的食物和营养来源之一，而子叶是种子胚的组成部分之—。本实验室在利用图位克隆的方法定位到控制大豆子叶折叠突变体的相关候选区段，后结合RNA-seq数据初步确定候选基因GmTOR1-1。本研究在以往研究的基础上对该基因进行了全长克隆，序列分析的结果表明该基因是编码一个微管蛋白TORTIFOLIA1-like家族成员，GmTOR1-1 组织表达分析结果表明GmTOR1-1 在子叶中表达量最高，是子叶特异性表达基因，与对照相比，GmTOR1-1在突变体的根、花中表达量呈极显著增加，在茎、13d种子、7d荚皮表达量呈显著增加，在20d种子呈极显著减少，在叶中呈显著减少；转基因拟南芥植株的表型分析结果显示转GmTOR1-1拟南芥叶片形状不规则，叶片表面不光滑，叶片卷曲。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 植物材料 2
1．1．2 实验菌株及载体 2
1．2 试剂及仪器 2
1．2．1 主要试剂 2
1．2．2 主要仪器 2
1．3 GmTOR11 基因cDNA全长的克隆 2
1．3．1 大豆植株DNA的提取 2
1．3．2 大豆各个组织总RNA的提取 2
1．3．3 cDNA第一链的合成 3
1．4 GmTOR11 基因序列分析 3
1．5 GmTOR11 基因植物过表达载体的构建 3
1．6 GmTOR11 基因组织表达分析 3
1．7 侵染拟南芥花序 4
1．8 转基因拟南芥阳性植株的鉴定 4
1．8．1 转基因植株的抗性筛选 4
1．8．2 转基因拟南芥阳性植株的鉴定 4
2 结果与分析 4
2．1 GmTOR11 基因的克隆 4
2．2 GmTOR11 基因的序列分析 4
2．3 GmTOR11 基因的组织表 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
达分析 6
2．4 GmTOR11 基因植物过表达载体的构建 7
2．5 转基因拟南芥阳性植株的检测 7
2．6 转基因拟南芥植株的表型分析 8
3 讨论 8
致谢 8
参考文献 9
附录 9
GmTOR11基因的克隆与功能研究
引言
引言
大豆（Glycine max（L.）Merr.）是重要的粮食和经济作物，种植广泛。子叶是种子胚的组成部分之—，大豆子叶的作用主要是在种子发芽出苗阶段供给幼苗养分，另外子叶还能够提高幼苗对病害虫以及各种不良环境的抗性，从而影响产量【1】。
目前，在许多植物中如拟南芥，金鱼草，番茄等，都有子叶突变体的报道。利用这些突变体允许我们揭开胚形态子叶发育的复杂性，鉴定一些子叶发育过程中的直系同源基因。拟南芥CUC（cupshaped cotyledon）基因，如CUC1，CUC2和 CUC3【2,3,4】，云杉NAC01，和SHOOT MERISTEMLESS (STM)【5】都参与顶端分生组织的形成和子叶的分化。STM负调节ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1)，拟南芥中此基因的突变打乱了子叶的生长发育【6】。KNOTTEDlike (KNAT6)通过STM/CUC途径对于SAM的保持和胚边界的确立起着重要作用【7】。另外植物胚胎发育过程中子叶和SAM的发育受生长素极性运输的抑制【8】。生长素输出载体PIN1的极性定位同子叶激发中生长素堆积的位置相关，子叶发育过程中生长素输入原基内【9】。pid enp双突变体像是“提灯”，缺少子叶的发育，这反映了ENP对于子叶的发育是必需的【10】。
自1988年首次建立基因枪和农杆菌介导的大豆遗传转化技术以来,围绕影响大豆转化效率提高的各种因素,国内外学者对大豆转化方法进行了多方面的改进【11】。然而，目前大豆的遗传转化效率还是很低，在报道的文献中，最高的也只达32.6%【12】。与大豆相比，拟南芥作为一种模式植物，具有其它植物无法替代的优点：（1）生长周期短，从萌发到种子成熟仅6周；（2）基因组小，125Mbp，约25900个基因；（3）基因组仅有5条染色体，1．3亿个碱基对，其染色体数量是玉米的1/20；（4）具有双子叶植物的所有特性，整个生命周期同样经过细胞的分裂、生长发育、分化、衰老、死亡等一系列生物学现象；（5）在有限的空间内可大量种植，收获大量的种子。通过对拟南芥基因组的研究，推动了许多其它植物相关基因的研究【13,14】。
综合国内外文献报道，虽然前人已经对很多植物子叶发育相关基因进行了研究，然而目前与子叶发育相关的研究在大豆上还不多。本实验室通过NaN360Coγ诱变大豆栽培品种“南农9416”得到一个大豆子叶折叠突变体，其典型的表型特征是子叶向外翻折，除此之外，其发芽率和株高明显降低，根系减少，生育期延长。品质含量测定结果显示：子叶折叠突变体的蛋白质及部分氨基酸含量显著提高，而油分含量显著降低【15,16,17】。介于子叶折叠突变体具有的特色表型，具有的潜在提高大豆品质性状的可能，前人已构建了大豆子叶折叠突变体与科丰1号品种的定位群体，利用图位克隆的方法并结合RNAseq数据，定位到控制子叶发育的相关的候选基因。因此，本研究旨在对其中一个候选基因GmTOR11 进行生物信息学分析，并利用拟南芥转化法研究其功能GmTOR11，为基因后续更深入的功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 植物材料
大豆子叶折叠突变体由大学国家大豆改良中心种质资源库提供，是通过NaN360Coγ诱变大豆栽培品种“南农9416”而得，其典型的表型特征是子叶向外翻折，大豆子叶折叠突变体cco材料于正常季节种植于大学江浦实验场。
1．1．2 实验菌株及载体

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