小麦白粉病是一种由专性寄生的小麦白粉病菌引起的真菌病害。已克隆的小麦广谱抗白粉病基因Pm21编码一个CC-NBS-LRR类的抗病基因NLR1-V，其抗性机制尚不明确。为了筛选Pm21的互作基因，本实验室前期利用酵母双杂技术获得一批CC结构域的互作蛋白，包含一个编号为309的水杨酸途径关键基因PAL（phenylalanine ammonia—lyase，PAL）。本研究利用VIGS（virus induced gene silencing，VIGS）技术，构建包含PAL片段的VIGS表达载体，在包含有NLR1-V基因的小麦-簇毛麦易位系（T6VS/6AL）中特异沉默该基因，通过病毒表型观察、接种白粉菌后离体鉴定和统计沉默植株的叶片菌丝发育数目，以及表达水平的基因沉默效率检测，初步结果表明PAL沉默能够引起NLR1-V介导的抗病性一定程度的削弱，推测该基因参与了NLR1-V介导的小麦抗白粉病通路，并且起到正向调节作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 酵母双杂实验材料2
1.1.1 酵母AH109菌株2
1.1.2 酵母双杂载体2
1.1.3 酵母双杂文库2
1.1.4 缺陷培养基2
1.1.5 XαGal3
1.2 VIGS材料3
1.2.1 感病材料3
1.2.2 抗病材料3
1.2.3 BSMV重组病毒载体3
1.3 方法 3
1.3.1 酵母双杂筛选NLR1V互作基因3
1.3.2 克隆候选基因PAL3
1.3.3 PAL基因的序列分析4
1.3.4 构建γPAL重组VIGS载体4
1.3.5 病毒载体线性化4
1.3.6 体外转录5
1.3.7 病毒接种5
1.3.8 PAL基因功能验证5
2 结果与分析6
2.1 NLR1V互作蛋白的筛选6
2.2 PAL基因的克隆6
2.3 PA *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
L的序列分析7
2.4 γPAL重组VIGS载体的构建7
2.5 VIGS载体线性化和体外转录9
2.6 重组病毒接种9
2.6.1 不同载体表型结果9
2.6.2 白粉菌形态及数量统计 10
3 讨论11
致谢12
参考文献12
NLR1V互作基因PAL的筛选及基于VIGS技术的初步功能验证
引言
小麦是世界上重要的粮食作物之一，其生活周期中会受到小麦白粉病的严重危害，防治小麦白粉病的最经济有效的策略是挖掘抗性基因进而培育抗性品种。其富含淀粉、蛋白质等营养物质，可用来生产面包、馒头等主食，具备重要的营养价值，我国也是世界上小麦生产、消费大国。小麦生育期长且小麦的整个生育期都可能遭受病毒侵害，其中危害最大的小麦病害之一就是小麦白粉病。小麦白粉病是由白粉病菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)引起的一种世界性真菌病害，可以借助高空气流进行远距离传播。白粉菌致病过程分为侵染和再侵染，生育期再侵染发生频繁。在适宜的温湿条件下，白粉病菌潜伏期只有三天，病原菌的侵染只需要一天就能完成[1]。小麦感病后，光合作用减少，呼吸和蒸腾作用加剧，养分大量流失，阻碍营养元素积累，导致严重减产。近年来，由于小麦种植数量和密度的增加、水肥条件变化等原因，世界主要麦区白粉病的危害日趋严重，由次要病害上升为主要病害[2]。因此对于小麦白粉病的防治迫在眉睫。
对于小麦白粉病的防治，可以通过喷施药剂、进行病情监控、加强栽培管理等进行有效防治，但最经济有效的方法是选用、种植抗耐病品种。小麦白粉菌在不同的地理生态环境和寄主相互影响下会发生变异，且白粉菌为无性繁殖，世代多，数量大，导致突变速度快，频率高。因此单一的抗病基因很容易丧失抗性，白粉菌能很快适应专化抗性品种。所以筛选抗原、富集抗病基因、拓宽小麦遗传基础，减缓抗性消失速率是培育小麦抗白粉菌品种成功的关键[3]。
小麦品种（系）中的抗病基因组成是进行抗病育种的重要依据。Loegering[4]根据Flor的基因对基因学说理论提出了抗病基因推导法，即用不同毒性的病原菌菌株接种已知抗白粉病基因的寄主，分析抗性基因。截止2017年9月，正式命名的小麦白粉病基因有70多个[5]，如Pm4a，Pm13，Pm43等。而近年来，一些抗病基因陆续在中国丧失抗性。
为发掘对小麦品种改良有用的基因，在大学细胞遗传研究所在小麦野生近源物种簇毛麦（Haynaldia villosa, 2n=14, VV）6VS上找到发掘了广谱高抗白粉病基因Pm21。Pm21几乎能免疫所有的白粉菌生理小种，表现出抗性高，抗谱广的优点。，并本实验室通过染色体工程的手段将该基因导入普通小麦，获得高抗白粉病的创造制了小麦—簇毛麦T6VS/6AL整臂易位系并广泛应用于小麦抗白粉病育种。Xing等（2018）通过，通过小片段渐渗系缩短Pm21所在区间，利用结合分子标记对目标区段中的NLR类基因富集测序技术进行挖掘，在T6VS6AL的易位系材料和其和感病突变体验证的方法中克隆得到获得Pm21基因，其编码一个典型的CCNBSLRR类R基因NLR1V。
为了进一步验证挖掘NLR1V基因介导的白粉病抗性机制，蛋白在小麦抗白粉病的抗病通路中与哪些基因蛋白相互作用，实验室前期利用酵母双杂技术，初步筛选了对NLR1V的基因蛋白与哪些蛋白有互作蛋白进行初步筛选，获得一批候选互作基因。通过基因注释发现编号309的基因为参与水杨酸通路的关键酶PAL。在酵母双杂筛选的众多候选基因中，通过结构域预测发现编号为309的基因为参与水杨酸通路的关键酶PAL。PAL即苯丙氨酸解氨酶( phenylalanine ammonia—lyase，PAL），是苯丙烷类代谢途径的关键酶，能将苯丙氨酸合成反式肉桂酸，最终生成水杨酸（Salicylic Acid，SA）[2]。SA是跟植物抗病相关的内源信号分子，可诱导多种植物，如小麦、拟南芥、水稻、烟草等病程相关蛋白（pathogenesis related protein，PR蛋白）的表达，跟其他植物激素如茉莉酸，乙烯等共同调控植物在遭受生物或非生物胁迫时信号转导途径，提高植物抵御病原菌侵染的效率。White[3]等人将SA注射进烟草叶片后，发现增强了植株对烟草花叶病毒（TMV）的抗性。已有研究发现，小麦感染白粉病后，PAL活性呈“最初缓慢上升、随后急剧上升、最后急剧下降”的趋势[4]。

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