大豆蛋白质含有较多种类的氨基酸，但含硫氨基酸含量低，降低了大豆的营养价值。虽然多年来凭借遗传改良的方法，已经获得一些高产、高油分、高蛋白的优质品种，但要获得持续高产高营养价值的大豆新品种，还存在很多局限性。大豆储藏蛋白主要包括大豆球蛋白(11S)和β-伴大豆球蛋白(7S)，研究表明大豆蛋白11S与7S是具有反比的关系，即当7S减少时，11S的含量就会增多从而保证总蛋白数量不发生变化，但是该调控机制目前仍不清楚。大豆蛋白7S具有较少的含硫氨基酸含量，特别是不包括半胱氨酸。因此，降低7S含量以提高大豆含硫氨基酸的含量，已成为大豆品质改良的一个重要方向。7S球蛋白又称为β-伴大豆球蛋白，基因Gm7Sα是编码β-伴大豆球蛋白(7S) 的α’亚基基因。本课题是对前人使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除基因Gm7Sα和基因Gm7Sα’获得的转基因植株进行表型观察和转基因检测。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1　试验材料 2
1.2　实验方法 2
1.2.1　Gm7Sα和Gm7Sα’定点突变植株分子生物学检测 2
1.2.2　Gm7Sα和Gm7Sα’定点突变植株相关基因的表达分析 3
1.2.3　Gm7Sα和Gm7Sα’定点突变植株的表型分析 4
2　结果与分析 5
2.1　Gm7Sα和Gm7Sα’定点突变植株分子生物学检测 5
2.2　潜在脱靶位点分析 5
2.3　Gm7Sα和Gm7Sα’定点突变植株相关基因的表达分析 5
2.4　Gm7Sα和Gm7Sα’定点突变植株的表型分析 6
3　讨论 8
致谢 9
参考文献 9
CRISPR/Cas9介导的Gm7Sα转基因材料的鉴定及其籽粒蛋白的分析
引言
大豆是世界上重要的粮食和油料作物，也是植食性蛋白质的重要来源，大豆蛋白质氨基酸组分齐全，但含硫氨基酸含量低，限制了大豆的营养价值[1]。大豆是我国重要的粮食作物之一[2]，对环境适应性强， *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
含有丰富的蛋白质，既可用作食用油原材料，也可用作喂养动物的饲料，因此，大豆的育种与栽培在我国备受重视[3]。在美国转基因大豆占据中国大豆大量市场份额的前提下，为保证中国自主大豆不完全被美国转基因大豆取代，甚至在未来让中国由大豆进口国转变成大豆出口国，就必须提高中国自主大豆的营养品质和单位面积产量。因此，在改良大豆营养品质的同时又能保持其产量的稳定甚至有所提高就成为大豆育种工作的重中之重。本课题研究的方向是通过利用CRISPR/Cas9基因编辑技术来增加大豆贮藏蛋白中含硫氨基酸的含量，改进大豆的营养品质，但是还处于本科阶段，就只是对CRISPR/Cas9介导的Gm7Sα转基因材料进行表型观察和转基因检测。
大豆球蛋白主要包括11S球蛋白和7S伴球蛋白[4]，酸性亚基A和碱性亚基B组成11S球蛋白, 7S伴球蛋白主要指β副球蛋白的α、α和β三种亚基[5]； 11S球蛋白含硫氨基酸比较丰富, 蛋白品质好, 豆制品的营养价值高,而7S球蛋白富含赖氨酸, 豆乳制品乳化性好, 豆腐凝聚性好、产量高, 具有较高的经济效益等[6,7]，但是7S含硫氨基酸含量更少，特别是不含有半胱氨酸。含硫氨基酸即半胱氨酸（Cys）和蛋氨酸（Met）在生物有机体的初级和次级代谢中产生非常重要的作用，并且具有免疫功能[8,9]。因此，降低7S含量以提高大豆含硫氨基酸的含量，已成为大豆品质改良的一个重要方向。CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced sht palindromic repeatsCas nuclease）是第三代基因编辑技术，由反式激活CRISPR RNA(transactivating CRISPR RNA,tracr RNA)序列区､Cas基因序列区和CRISPR序列区三部分组成[10]。利用生物工程手段改良蛋白品质即提高食用大豆含硫氨基酸的含量，有效的措施之一就是对编码β伴大豆球蛋白(7S)基因进行遗传操作，即将其敲除。
1材料与方法
1.1 试验材料
由大学理科南楼国家大豆改良中心提供的Gm7Sα和Gm7Sα’定点突变T1大豆植株及其所收获的籽粒。
1.2 试验方法
1.2.1 Gm7Sα和Gm7Sα’定点突变植株分子生物学检测
1）定点突变植株叶片DNA的提取
T1代的每株苗取适量新鲜、无缺陷叶片，本试验采用植物基因组DNA提取试剂盒来提取DNA。DNA提取具体步骤如下：
（1）取植物新鲜组织100mg或干重组织20mg放入离心管中，同时在管中加入小钢珠，放入液氮中冷却，然后在研磨机上充分碾磨。接着加入400μL缓冲液LP1和6μL RNaseA（10 mg/mL），在涡旋机上旋涡振荡1min，室温放置10min；
（2）在离心管中加入130μL缓冲液LP2，充分混匀，接着在涡旋机上旋涡振荡1min；
（3）将离心管放置离心机中，对齐配平，12000rpm（~13400×g）离心5min，将上清移至新的离心管中，旧的离心管丢弃；
（4）在新的离心管中加入1.5倍体积的缓冲液LP3（例如500μL的上清液加750μL缓冲液LP3），离心管管盖盖紧，立即充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀；
（5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱之前已经放入收集管中，将吸附柱和收集管的结合体一起放入离心机中，对齐配平，防止盖子破碎，12000rpm（~13400×g）离心30sec，拿出吸附柱，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB3再放入收集管中；
（6）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm（~13400×g）离心30sec，拿出吸附柱，倒掉集管中的废液，将吸附柱CB3再次放入收集管中；
（7）重复操作步骤6；
（8）将吸附柱CB3放回收集管中，对齐配平，12000rpm（~13400×g）离心2min，拿出吸附柱，倒掉收集管中的废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
（9）将吸附柱CB3转入一个干净、没有使用过的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50200μL洗脱缓冲液TE，室温放置25min，再放入离心机中，对齐配平，12000rpm（~13400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中。
2）PCR检测标记基因
以植株叶片DNA为模板，表1中设计的BarF和BarR为引物，进行PCR扩增。用1.0%琼脂糖凝胶电泳进一步检测植株是否为阳性苗。

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