棉花是世界上主要的经济作物之一，在中国有着广泛的种植面积，由于棉花的产量大成本低使得它被广泛应用于各个方面。自从美国孟山都公司研制出转基因棉花种子后，化学用药对生态环境等方面的危害得以减轻，棉花的防治也进入新的时期。苏云金芽胞杆菌基因也被称为BT基因，是被应用最为广泛的杀虫基因。随着种子市场的发展，市场现状也变得鱼龙混杂，假冒伪略产品的出现，使得转基因棉花种子的真实性受到质疑，如何简便快捷的测定种子真实性便是重中之重。本文主要是利用PCR技术来构建一种鉴定转基因种子真实性的方法，试图找到一种更加简单的方法，也为今后的发展提供基础的帮助。本次实验通过构建的PCR检测方法成功的检测出样品种子中Bt基因的存在，表明这批种子为转Bt基因棉花种子，验证了它的真实性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1新鲜棉花幼叶的培育2
1.2方法 3
1.2.1实验依据3
1.2.2试材与仪器3
1.2.3实验步骤3
2 结果分析6
2.1 棉花发芽实验结果6
2.2 RNA电泳检测6
2.3 cDNA电泳检测7
2.4 PCR产物电泳检测7
2.5实验的完善7
3 讨论 7
致谢8
参考文献8
转Bt基因棉花种子的定性PCR检测方法构建
种子科学与工程 赵光珂
引言
引言
转基因技术是现代生物科学技术的一大要点，转基因植物的发展应用不断扩大，Bt基因也是其中一种应用较多的杀虫基因，被运用于各类农业作物之上。Bt基因即是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)基因，相对于其它芽孢杆菌，不仅能够形成芽胞，同时还能产生由杀虫蛋白组成的晶体。它的抗虫原理是在苏云金芽孢杆菌的生活代谢过程中，会产生一种Bt杀虫蛋白，该蛋白对多种害虫具有毒杀作用[1]。
转Bt基因抗虫棉是将苏云金芽孢杆菌的Bt *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
基因导入到转基因抗虫棉的叶肉细胞中去，在把Bt基因转入棉花中后，它也会产生这种杀虫蛋白，起到抗虫作用。转Bt基因抗虫棉的杀虫谱有着一些不同，主要是Bt基因的差异导致的，我国现有的转基因抗虫棉对棉铃虫、红铃虫、卷叶虫等鳞翅目的害虫抗性良好[2]。
在国内 ,谢道昕[3]等人1991年首次报道将Bt毒素基因通过花粉管途径导入我国棉花品种中，中国农业科学院生物技术中心将人工合成的毒素基因与改造后的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CPTI) 基因重组构成双价抗虫基因,并导入植物[4]；中国农科院棉花所培育出中棉所Bt棉系列品系,1994～1995年在冀鲁豫等省的示范试验中 ,表现出良好的抗虫性和丰产性[5],优良品系在参加全国品种区域试验。自从我国农业部在1997年首次批准了转基因棉花的商业化种植之后，我国对于棉花病虫害的预防整治也终于来到了新的阶段[6]。其抗虫性、丰产性均表现出良好效果,减少了化学农药用量大约50%～80%，皮棉的产量与当地推广品种大致相当,有效地减轻了环境污染，保护了天敌,促进了棉地乃至整个农田生态系统的良性循环发展。转基因棉花已有品种通过审定应用于农业生产，人们不仅对棉花产量关心，而且也十分重视其目标性状的表现，就抗虫棉种子而言，种子的纯度和全生育期的毒蛋白表达状况决定其抗虫性，因此毒蛋白的定量、定性检测是生产上转基因抗虫棉鉴定和评价的有效手段。
转BT基因棉花在国内的广泛种植，棉花产量也取得了很大增长，但转基因品种的大量推广应用，种子市场出现了以假冒伪劣转基因品种的销售问题[7]，虽说种子市场的现代化水平有了显著的提高，但是也使得许多以前不太明显的问题渐渐暴露在人们眼前，这些难题极大地限制了我国种子产业的进一步发展。如何对种子质量进行科学的监督与管理，也是现代农业部门的重要管理内容[8]，是维持种子市场秩序的重要环节，故对种子的真假鉴定也是必需的一项。PCR技术便是一项简单、快捷、准确的技术，它在各个领域的广泛应用也为本项实验打下了坚实的基础，本次主要运用定性PCR技术来对转Bt基因的棉花种子进行检测，进而对种子的真实性进行深一步的探讨研究，找到一条合适快捷的分辨方法。一种简单准确的检测技术有助于种子市场中标记监管制度的实施，本文利用PCR技术的特性，来检测转基因棉花中存在的Bt基因，来鉴定转基因种子的真实性，根据以往的材料来构建这种简单有效的转基因种子测定方法。
PCR技术是方法构建的重中之重，PCR技术是模拟体内DNA的天然复制过程，在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术，主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段[9]。PCR 方法有着良好的准确性和稳定性，是目前应用最多的转基因检测技术，世界上已存在的转基因检测方法大多数都是以PCR技术为基础建立的。与 1个反应体系中仅能检测1种靶标DNA的单一PCR相比，多重PCR方法通过在单个反应管中加入多种靶标DNA的检测引物，可在1个反应体系中同时检测多至10余种靶标DNA，大大提高检测效率，现已越来越多地应用到转基因检测方法研究中[1011]。针对转基因作物的检测方法，国内外也不尽相同，就我国而言，主要使用定性PCR方法，而欧盟联合实验室则多为定量PCR方法[12]。两种也都有着自己的特点，定量PCR技术以其实时、灵敏度高和对污染少等特性取得了迅速的发展，大有完全取代普通定性PCR技术的趋势。但由普通的定性PCR方法发展起来的复合PCR能快速、简便鉴别多个靶标序列，这在定量PCR上则是很难实现的。本实验以转Bt基因的棉花种子为材料，定性PCR技术为基础，来构建一种颗准确判断是否含有Bt基因片段存在的技术方法。
1 材料与方法
1．1 材料
1. 1新鲜棉花幼叶的培育
种子消毒：先把棉花种子用75%的乙醇表面消毒5分钟，然后用1%的过氯酸钠处理10分钟，再将其放入蒸馏水中30分钟，之后冲洗干净。
（3）温汤浸种：将消毒完毕的种子放置于100ml的烧杯中，之后用水浴锅加热，放入水浴锅后保持温度在28℃，浸种48小时后取出，将取出的棉花种子放在滤纸上，吸干水分后，准备放入花盆种植。
（4）放置培养：选取直径5cm的花盆，共计25盆，在花盆的底部放入两层培养纸，然后放入厚度约5cm的砂土，砂土要经过高温灭菌处理，每盆放入2粒种子，然后加盖1cm到2cm的松散砂土，砂土要保持在可以凝成一团，再可用手指轻轻按压就碎即可[13]，将全部花盆放在托盘上置于发芽室中培养。

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