小麦近缘物种簇毛麦是普通小麦重要的三级基因资源库，通过对簇毛麦相关NLRs类基因的发掘可以拓展小麦的抗病基因资源。本实验室通过大麦专化NLRs-baits文库富集二倍体簇毛麦品系91C43全基因组NLRs类基因，并结合第三代基因测序技术，获得了簇毛麦全基因组水平的NLRs基因序列数据库。本实验利用生物信息学比对的方法，将已获得的簇毛麦NLRs基因序列的contig与近缘物种大麦，以及普通小麦中国春参考基因组数据进行高通量比对，发掘相应同源序列间因进化过程中的缺失、插入、重复等原因所产生的基因组序列差异。根据这些差异片段设计出簇毛麦序列特异引物715对，在小麦—簇毛麦整臂易位系、中国春、簇毛麦等材料进行PCR扩增，确定对应簇毛麦NLRs类基因在染色体上的分布。根据以定位结果，共开发出簇毛麦各染色体臂特异的Indel分子标记174个，其多态率达到24.3％。这些基于NLRs类基因开发的专化分子标记，既可用于辅助簇毛麦易位系等染色体工程材料的选育和鉴定，同时又为后续功能基因的定位和克隆奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1引言1
2材料与方法1
2.1实验材料 2
2.2实验方法 2
2.2.1簇毛麦NLRs基因的测序2
2.2.2簇毛麦Indel分子标记引物设计2
2.2.3整套小麦—簇毛麦整臂易位系鉴定3
2.2.4实验材料DNA提取3
2.2.5簇毛麦NLRs基因分子标记的扩增3
2.2.6扩增产物的检测3
2.2.7簇毛麦NLRs基因Indel分子标记开发4
3结果与分析 4
3.1 所用细胞学材料鉴定4
3.2 Indel分子标记引物设计4
3.3 簇毛麦NLRs基因Indel分子标记的PCR验证4
3.4 簇毛麦NLRs基因染色体定位6
4讨论 6
致谢7
参考文献7
附录 实验胶图整理8
簇毛麦NLRs类基因的染色体定位和分子标记开发
引言 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 

1 引言
小麦是我国重要的粮食作物，但随着农业的现代化发展以及对小麦品种的定向选择，造成了小麦基因资源、遗传资源、种质资源的严重流失，小麦品种多样性受到破坏。这不但降低了我国小麦的产量与品质，也增加了农民对小麦病虫害防治的成本，降低了经济效益和农民生产的积极性。对于小麦病害造成的严重损失，培育具有抗性功能的小麦新品种是最为经济有效的一种方法。但是小麦常规育种的育种周期长，材料抗性鉴定费时费力，这使得小麦育种效率较低。分子标记辅助育种的出现，可以通过基因型的选择来判断表型，在苗期即可进行相应性状的选择，不再受环境因素的制约，极大地提高了育种效率[12]。
植物先天免疫系统由两个主要的免疫反应组成，即病原相关分子模式激发的免疫反应（PTI）和效应蛋白激发的免疫反应（ETI）。其中，PTI由病原微生物表面的病原相关分子模式（PAMP）（如多糖、鞭毛蛋白等）刺激诱导，可导致植物产生非特异性的防卫反应（基础防卫反应）；ETI则是由植物抗病基因（Resistance gene，R基因）编码的抗病蛋白识别病原微生物产生的效应蛋白（即无毒蛋白，avr蛋白）引发，可使植物产生特异性的防卫反应（Jones and Dangl，2006）。对于R基因的研究一直是作物抗病性研究的热点。已有的研究表明植物的R蛋白在结构上非常保守，其中最大类属于编码包含核苷酸结合位点（nucleotidebinding site，NBS）和亮氨酸重复结构（leucinerich repeat，LRR）保守基序的抗病蛋白（Dangl and Jones，2001；Hulbert et al.，2001），即NBLRRs（以下简称NLRs）。已克隆的60多个R基因中80%以上都属于NLR类。
当今以PCR为核心的分子标记广泛应用于分子辅助育种。以PCR技术为核心的分子标记被称为第二代分子标记主要包括STS、RAPD、AFLP、SSR、Indel等。其中RFLP是根据基因型之间限制性片段长度的差异进行设计。STS以生物的基因组中常存在大量的单拷贝序列设计开发的标记。RAPD标记是利用合成的随机引物(一般为8～10个碱基)对基因组DNA进行PCR扩增。SSR标记是指基因组中存在的由2 5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。而Indel分子标记根据同源序列间的插入或缺失序列进行设计分子标记自身具有开发成本低，结果准确，操作简单多态率高的特点[15]。
簇毛麦作为小麦抗病育种的重要基因库，携带抗白粉病、条锈病、秆锈病等数十种病害的抗性基因或位点，但其滞后基因组研究严重限制了其优异抗病基因的发掘和应用。从现有的报道来看对簇毛麦NLR类基因组的研究较少，而且大多集中在1V和6V染色体上[2`7]。簇毛麦分子标记开发大多以SSR 标记和STS标记较为常见，少有簇毛麦Indel分子标记相关的报道。本研究正是根据分子标记以及R基因在育种中的重要作用，以及簇毛麦的研究现状和Indel分子标记易开发的特点，对簇毛麦进行Indel了分子标记的开发，为后续的染色体工程材料的选育和鉴定和相关功能基因的定位和克隆奠定基础。
2 材料与方法
2．1 实验材料
实验材料包括普通小麦中国春( Triticum aestivum，CS)、二倍体簇毛麦品系91C43 (Haynaldia villosa，HV)、硬簇麦（ABV)、整套小麦—簇毛麦整臂易位系。其中所用到的簇毛麦来自于英国剑桥植物园，而普通小麦中国春( CS)、二倍体簇毛麦品系91C43 ( HV)、整套小麦—簇毛麦整臂易位系(ABV)均由大学细胞遗传所提供。
2．2 试验方法
2．2．1簇毛麦NLRs基因的测序 因簇毛麦和大麦的亲缘关系较近，根据NLRs类基因保守结构域设计合成大麦NLRs专化RNABaits文库（TSL）并作为为钓饵，通过分子杂交富集二倍体簇毛麦品系91C43的基因组水平的NLRs类基因，富集的簇毛麦NLRs基因序列经第三代高通量测序技术PacBio测序，获得簇毛麦全基因NLRs类基因的序列数据库。
2．2．2 簇毛麦Indel分子标记引物设计 簇毛麦通过RenseqPacbio测序并组装获得了含有NLRs基因的contig。根据已获得的簇毛麦NLRs基因的contig与普通小麦IWGSC数据库中的参考序列进行进行Blastn。依据其比对出的结果寻找二者同源序列间差异，尤其是插入或缺失区段。在比对的过程中，选择在两个插入或缺失多于3个碱基的序列位点处分别设计正向和反向引物，两个差异位点在200bp500bp之间，利用软件 Primer 5 进行引物设计，引物长度 1824bp，Tm 5458℃，GC 含量 4060%。此次实验所用到的引物由金斯瑞引物科技公司合成。
2．2．3整套小麦—簇毛麦整臂易位系鉴定 对整套小麦—簇毛麦整臂易位系的鉴定采取分子标记鉴定法。对于被鉴定的实验材料，先提取其DNA。然后根据已开发的簇毛麦的特异分子标记合成引物，再以提取实验材料的DNA为模板进行PCR扩增，根据凝胶电泳结果进行判断。如果可以扩增出特异片段则说明实验材料符合要求，可以进行下一步DNA的提取。如果不能扩增出特异片段则需要继续选择新的实验材料进行DNA的提取。

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