烟草主要是以叶片为主要收获对象的经济作物，烟草早花是烟草栽培中常见的灾害现象。发生早花的烟株植株矮小，有效叶数少，不仅削弱了烟草的生长势、直接影响烟草的产量，还可能会影响到烟叶内在化学成分的协调、进而影响烟叶品质。本研究在对模式植物已有信号通路基因进行分析以及结合逆境胁迫下基因表达谱分析的前期基础下，根据转录组测序结果，从中选择了20个候选基因进行VIGS载体的构建，后利用VIGS基因沉默技术对候选基因进行了基因沉默；通过基因沉默之后的开花表型鉴定，最终确定其中4个基因与烟草开花调控相关。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
1前言 4
1.1研究背景 4
1.2国内外研究状况 4
2材料与方法5
2.1试验材料 5
2.2 试验方法 5
2.2.1本氏烟草的培养 5
2.2.2 VIGS载体的构建5
2.2.2.1候选基因VIGS靶标片段的PCR扩增 5
2.2.2.2将候选基因VIGS靶标片段克隆到gateway入门载体中5
2.2.2.3将靶标片段的克隆到gateway VIGS目的载体TRV2中5
2.2.2.4将带有靶标片段pTRV2 VIGS目的载体转入农杆菌 6
2.2.3采用VIGS技术进行基因沉默6
2.3表型观察与数据处理 6
3 结果与分析 7
3.1候选基因引物设计 7
3.2候选基因载体构建 8
3.3开花时期各基因对应植株表型 9
3.4开花植株株数差异性分析11
3.5开花时生长天数差异性分析12
3.6开花时叶片数差异性分析12
3.7结论13
致谢14
参考文献14
烟草开花调控基因的筛选及表型鉴定
指 导 教 师 邹保红
引言
1 前言
研究背景
烟草是我国重要的经济作物之一，烟草行业在我国的国民经济总量中占有很大比 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
重。目前，我国烟草的种植总面积以及烟叶的总产量均居世界首位，栽培生产烤烟主要集中在云南、贵州、四川、河南、湖南、福建等地，在我国西北、东北等部分地区也栽种了少量的黄花烟。栽培的品种主要为普通烟草(Nicotiana tabacum L.)和黄花烟草两种(Nicotiana rustica L.)。普通烟草又称红花烟草，如烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等，黄花烟则均为晒烟。烟草产量极大的受到烟草植株花期的影响，逆境条件情况下烟草早花极易发生，发生早花的烟株不仅植株矮小，有效叶数少，而且叶片薄又小，严重影响了烟叶的产量、品质和经济效益。我国主要的烟草种植区域均发生过不同程度的早花灾害现象，对烟草产区经济造成了较大的影响，所以筛选出调控烟草开花的有效基因迫在眉睫。
病毒诱导的基因沉默(Virusinduced gene silencing，VIGS)是指携带目标基因片段的病毒在侵染植物后，诱导植物内源基因沉默、引起表型变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。VIGS是根据植物对RNA病毒防御机制发展起来的一种技术，其内在的分子基础可能是转录后基因沉默(posttranscript gene silence)。与传统的基因功能分析方法相比.VIGS能够在侵染植物当代对目标基因进行沉默和功能分析；可以避免植物转化；克服功能重复；可以在不同遗传背景下起作用，对基因功能分析更透彻。VIGS已被广泛应用于植物抗病抗逆、生长发育以及代谢调控等生理途径相关基因的功能鉴定。与转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比，VIGS技术研究周期短，不需要遗传转化，具有低成本、高通量等优势。目前，病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术已被证明是一种快速、高通量筛选烟草抗逆功能基因的技术。利用VIGS体系验证参与逆境胁迫诱导早花过程中烟草候选基因功能，可进一步缩小候选基因范围。
1．2 国内外研究状况
目前，已有许多研究者在植物开花调控方面做出了较多研究，如weigel等[1]通过研究LFY突变体，首先利用RFLP(限制性片段长度多态性)技术，从拟南芥中克隆出基因LFY，它不仅决定花分生组织的形成，而且控制开花时间。在这之后，科学家们也在烟草中分离克隆到了基因LFY，它具有协同其它成花相关基因抑制分生组织细胞向营养生长发育的功能，同时参与花分生组织的形成、属性的决定以及进一步的发育。基因LFY的表达不仅受到植株成花过程中相关基因的促进，而且受赤霉素(GA)、抗坏血酸(ASA)、碳源、环境等诸多因素的影响。Eckardt等[2]研究表明，成花素(florigen)是植物叶片中的一种FT蛋白，被输送到茎尖与FD蛋白结合，使植物茎尖中的SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPERSSION OF CO 1)表达量得到升高，促使花芽分化提前。在正常条件下，FLC(FLOWERING LOCUS C)基因控制叶片中FT(FLOWERING LOCUS T）、FD和SOC1的表达，阻碍早花现象的发生。但低温条件下，FLC基因的表达会受到明显抑制，从而促进SOC 1表达，诱导开花。Smykal等[3]从烟草中克隆了与开花时间相关的基因NicotianaSOC1(NtSOC1)和NticotianaFUL(NtFUL)，并经过试验表明它们与光周期特性有关，通过表达能引起烟草的提早开花。王小彦等[4]通过低温等处理烟草后，分析了低温诱导烟草早花中的SOC1以及一些与代谢相关的酶、部分植物生长物质的基因表达变化。李元元等[5]根据不同植物MADSbox家族基因的保守区序列，通过设计简并引物，从烤烟品种NC82中克隆出了MADSbox家族的同源基因。
VIGS病毒诱导基因沉默技术由于具有快速、高效、高通量等明显优点，使得VIGS技术很快成为植物功能基因组学研究的重要技术手段之一。VIGS技术自问世以来研究不断，VIGS载体病毒范围不断扩展。1995年，Kumagai等[6]首次完成了基于烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)的VIGS载体构建，携带八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase, PDS) cDNA片段的重组病毒侵染烟草后，接种位置以上的叶片出现褪绿白化现象，并伴随着PDS mRNA水平的显著降低，并常被作为实验的对照，随后，Ratcliff等[7]基于烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV)的VIGS载体体系构建成功，因其具有病毒症状较轻、沉默效率高、持续时间长及能够侵染分生组织等优点，在模式植物烟草、拟南芥中有较为广泛的应用。1998年，Kjemtrup等[8]基于双生病毒番茄金色花叶病毒(Tomato golden mosaic virus TGMV)的VIGS体系成功建立．2010年，Purkayastha等[9]通过水稻东格鲁杆状病毒(Rice tungro bacilliform virus，RTBV)也被改造为VIGS 载体，通过农杆菌介导接种实现了水稻内源基因 PDS 的高效沉默。2002年，Gosselé 等[10](2002)首次完成了对伴随 TMV U2 株系的卫星病毒 STMV 的 VIGS载体化改造，并成功实施了对烟草 PDS 等多个植物内源基因的沉默。2012年，周雪平教授[11]的研究团队先后报道了基于中国番茄黄化曲叶病毒卫星Betasatellite(即DNAp)和基于烟草曲茎病毒卫星Alphasatellite(即DNA1)的VIGS载体。

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