一个水稻叶色基因的图位克隆【字数：12664】
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法1
1.1 植物材料与生长条件1
1.2 叶绿素含量测定2
1.3 农艺性状的考察2
1.4 叶色基因的初定位2
1.4.1 叶色基因的遗传分析2
1.4.2 水稻叶片DNA的提取2
1.4.3 PCR反应2
1.4.4 PCR产物的检测2
1.4.5 标记的开发和筛选3
1.5 候选基因的预测3
1.6 RNA的提取和反转录3
1.7 实时荧光定量PCR反应4
1.8 CRISPR/Cas9载体和1305GFP过表达载体的构建4
1.8.1 目的基因片段和载体的回收5
1.8.2 pMD18T载体连接和pEASYBlunt载体连接5
1.8.3 目的基因和载体的重组5
1.8.4 大肠杆菌化学转化法和检测5
1.8.5 质粒的提取方法6
1.8.6 农杆菌介导转化法6
1.9 亚细胞定位载体的构建和转化7
1.10 蛋白序列比对和进化分析7
2 结果与分析7
2.1 叶色突变体的表型描述和色素含量测定7
2.2 农艺性状调查8
2.3 叶色突变体的遗传分析9
2.4 叶色基因的定位9
2.5 候选基因的预测10
2.6 OsBE1蛋白的亚细胞定位11
2.7 OsBE1同源蛋白比对和进化分析12 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥
2.8 OsBE1基因的敲除载体构建和过表达载体构建13
3 结论与讨论14
致谢15
参考文献16
附录17
一个水稻叶色基因的图位克隆
引言
叶色突变在大田育种、植物组织培养以及人工诱变的过程中能经常发生，因其易于观察、突变频率高的特点，在各植物物种中被广泛鉴定。在水稻中已经至少有200多个水稻叶色突变体被研究或发现过[1]。研究最多的一类是失绿型叶色突变体，其中直接原因大都是叶绿素合成受阻，从而使得叶片黄化，甚至有的呈现白化性状。叶色变化和植物整个生长发育密切相关，比如植物光合作用、叶绿体发育等[2]。并且叶色突变也可以应用于水稻高产育种和杂交水稻的创制中[3]。因此，研究叶色突变体，不论是对于基础研究还是实践应用都具有重要的意义。
本研究对于一个水稻叶色突变基因进行了研究，对其进行了初步定位，并预测了定位区间内的可能的候选基因，对候选基因进行了相关分子生物学实验验证。本实验为进一步探索该基因发挥的作用机制，以及叶色突变机理奠定了重要的基础。
1 材料与方法
1．1 植物材料与生长条件
本实验材料是由粳稻品种Kitaake经过EMS化学诱变产生的一个田间苗期为白化，后期为条纹的突变体。野生型Kitaake、白化突变体和分离群体于水稻生长季节种植于南京市江宁区土桥基地；种子来源于大学作物遗传与种质创新国家重点实验室。野生型Kitaake和白化苗突变体的回交F2群体以及白化苗突变体和籼稻N22品种的杂交F2群体种植于光照培养箱（光照强度160μmol photons m2s1，恒温30℃，光照12h，黑暗12h，空气相对湿度85%）；温度梯度实验中，野生型Kitaake和突变体种植在光照培养箱（光照强度160μmol photons m2s1，光照12h，黑暗12h，空气相对湿度85%），温度条件分别为恒温20℃，恒温25℃，恒温30℃，恒温35℃。其中野生型Kitaake和突变体的回交F2群体用于遗传分析。突变体和籼稻N22品种的杂交F2群体用于连锁分析和基因的初定位。
1．2 叶绿素含量测定
色素含量测定参考前人报道的分光光度计测定法[4][5]。温度梯度实验处理中，选取在培养箱中培养到第10天的苗的第2叶进行叶绿素含量测定。将新鲜叶片用剪刀剪碎并称重。在2mL的95%乙醇中避光浸泡48h，期间多次混匀，设定3个重复。离心后取上清液用于后续测定。吸取上清液于比色皿中，以95%乙醇为空白对照，使用紫外可见分光光度计（U1800，日立）测定在470nm、649nm和665nm处的吸光值。样品中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素浓度的计算公式如下：Ca=13.95D6656.88D649；Cb=24.96D6497.32D665；Ca+b=Ca+Cb。然后按下述公式计算样品中个色素的含量，单位用每克鲜重样品所含色素的毫克重量表示（mg/g FW）：叶绿素含量=色素浓度C（mg/L）×提取液体积V（L）÷样品鲜重W（g）。
1.3 农艺性状的考察
在水稻抽穗时期，考察野生型Kitaake和突变体的主要农艺性状，主要包括株高、分蘖数等；籽粒成熟后调查主要的产量性状，包括穗长、粒长、粒宽、千粒重等；每个性状调查10个重复。
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/561107.html
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