本文以‘砀山酥梨’为材料，研究细胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）调控基因Metacaspase与梨石细胞形成可能的关系，梨果肉细胞中的过氧化氢（H2O2），采用Klason法及冷冻法分别获得果肉细胞中木质素及石细胞含量的动态变化；结合实验团队所做的生物信息学分析，找到相关蛋白酶，植物PCD过程中普遍存在的类Caspase酶，提取其RNA，经反转录得到cDNA后进行半定量操作，最后选取表达量较高的基因进行克隆。结果表明，在梨果肉细胞程序性死亡过程中，活性氧的合成、木质素的积累和Metacaspase基因的调控都是影响石细胞形成的重要因素。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试材及取样 2
1.2 不同时期梨果肉中石细胞含量的测定 2
1.3 不同时期梨果肉中木质素含量的测定2
1.4 不同时期梨果肉中过氧化氢含量的测定2
1.5 梨果实细胞死亡基因筛选及克隆2
1.5.1 Metacaspase基因序列收集和特征分2
1.5.2 Metacaspase的系统发育分析3
1.5.3 Metacaspase的蛋白序列结构 3
1.5.4 总RNA的提取及cDNA的合4
1.5.5 Metacaspase基因的克隆方法4
2 结果与分析5
2.1 过氧化氢、木质素与石细胞含量之间的关系5
2.1.1 ‘砀山酥梨’果实发育过程中石细胞含量的变化5
2.1.2‘砀山酥梨’果实发育过程中木质素含量的变化7
2.1.3‘砀山酥梨’果实发育过程中过氧化氢含量的变化8
2.1.4各指标项变化的相互关系8
2.2 诱导PCD相关基因的分析与克隆9
2.2.1 梨Metacaspase基因的理化性质分析9
2.2.2 梨Metacaspase基因的PCR扩增9
2.2.3 菌落PCR10
2.2.4 Metac *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
aspase基因测序10
3 讨论11
3.1 结果分析的总结11
3.2 改善梨品质的建议12
致谢13
参考文献13
图1 梨Metacaspase同系基因共识结构 4
图2 ‘砀山酥梨’果实发育期间石细胞含量的变化6
图3 ‘砀山酥梨’果实发育期间石细胞团直径的变化6
图4 ‘砀山酥梨’果实发育期间木质素含量的变化7
图5 ‘砀山酥梨’果实发育期间过氧化氢含量的变化7
图6 ‘砀山酥梨’果实发育期间木质素、过氧化氢含量和石细胞含量的变化关系8
图7 ‘砀山酥梨’果实Metacaspase 基因PCR扩增10
图8 ‘砀山酥梨’果实Metacaspase 基因菌落PCR10
图9 Pbr018439.1基因测序结果11
表1 梨的12个Metacaspase同系基因3
表2 PCR引物基本信息4
表3 ‘砀山酥梨’果实发育期间木质素、过氧化氢含量和石细胞含量的变化关系8
表4 梨Metacaspase同系基因的特征分析9
梨石细胞形成和Metacaspase基因的关系
引言
‘砀山酥梨’（Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’）是一种驰誉中外的梨品种，因为出产于安徽省砀山县而得名，该品种梨个大核小，皮薄汁浓，果皮黄亮，果肉呈乳白色，口感较粗，有淡淡的清香。‘砀山酥梨’不仅含有丰富的营养成分，还有独特的食疗功效。近年来，由于品种逐渐退化以及栽培管理技术不到位等原因，梨石细胞含量增多，导致果肉质地变粗，口感多渣，对果实品质造成了严重的影响。因此，关于梨果实石细胞形成机理的研究，对于改善我国梨品质具有十分重要的意义。
梨果实石细胞是一类强烈木质化的细胞[1]，其含量、大小和密度都是影响果实品质的重要指标，石细胞的形成发育会受到生理因素、基因、环境等因素的调控。果实发育过程中木质素发生沉淀，从而形成石细胞。近年来，国外各方面的研究表明木质部和导管分子的形成[23]等都可诱导植物细胞发生细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD），植物PCD同植物细胞的木质化等密切相关。活性氧( reactive oxygen species，ROS )是诱导PCD的一个重要信号分子，氧化胁迫诱导的植物细胞 PCD与相关代谢过程的蛋白相关。Metacaspase是植物PCD发生过程中普遍存在的一类蛋白酶，利用Caspase抑制剂的生化方法和转基因研究亦证明Metacaspase蛋白酶参与了植物PCD的调控[4]，其很有可能是PCD核心机制的一部分。本研究以‘砀山酥梨’为材料，对果实发育过程中不同时期的石细胞、木质素和过氧化氢含量进行测定，分析梨果实石细胞形成过程中生理因素可能存在的作用，并克隆与梨石细胞形成有关的Metacaspase基因，讨论石细胞PCD与木质化关系以及植物Metacaspase在PCD中的可能作用，旨在为探索调控石细胞形成发育的关键基因提供一定的理论依据，针对梨品质下降的现实问题，提出选育培养良种梨的相关建议。
1 材料与方法
1.1 试材及取样
试验材料为‘砀山酥梨’（Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’），选择树势健壮，栽培管理相同的果树，依据陶书田等［5］的方法对梨果实发育过程中石细胞团发育规律进行研究，从梨盛花期正常授粉后15d至果实膨大期，根据果实发育状况每隔7d采一次样（果实发育前期为5～6d）。每次采集果实20个（幼果适当多采），当天用冰袋保存由试验田带回实验室，样品清洗去皮将果肉削成片，经液氮速冻后装袋于20℃冰箱中保存备用，留一部分直接进行RNA的提取。

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