种子活力是种子质量的一个重要指标，其直接影响种子发芽速度、整齐度，决定幼苗根长和芽长。在前期研究中，利用蛋白组学技术鉴定了一个与水稻种子活力相关的基因，位于水稻第12号染色体上，将其命名为OsIPMS12。本实验使用了CRISPR-Cas9技术构建的点突变材料、过量表达及启动子活性分析转基因株系。实验结果表明OsIPMS12基因主要在穗、小花、节间及发育的种子中表达；苗期受到盐和干旱诱导表达。该基因突变后，影响了种子活力及对逆境的适应，发芽结果表明该基因突变后会降低水稻种子的发芽速度，并影响幼苗的根长和芽长。以上研究表明，OsIPMS12基因可能参与了种子萌发过程，该基因对提高种子活力具有一定作用，为以后研究该基因在调控种子萌发中的作用提供基础。
目录
摘要1
关键词.1
Abstract..1
Key words...1
引言.1
1材料与方法.1
1.1材料准备 .1
1.2 RNA的提取 .2
1.3RNA反转录2
1.4 RealTime PCR.....................................3
1.5 DNA提取..............................3
1.6GUS染色.4
1.7 基因表达分析..4
1.8 种子活力鉴定..4
2结果与分析4
2.1 基因获得.4
2.2 材料鉴定5
2.2.1点突变植株鉴定5
2.2.2 GUS转基因株系阳性5
2.2.3 过表达转基因植株阳性验证...5
2.3 基因组织表达特点6
2.4 OsIPMS12基因在不同发育阶段及逆境条件下的表达.6
2.5种子活力鉴定.7
2.5.1 正常条件下突变体及转基因材料的种子活力鉴定...7
2.5.2 200mM NaCL胁迫条件下突变体及转基因材料的种子活力鉴定8
3讨论8
致谢9
参考文献9
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OsIPMS12的功能分析
引言
我国是世界上最大的稻米生产和消费国，水稻作为我国第一大粮食作物，它的稳定生产是国家粮食安全的基本保障，具有十分重要的意义。水稻种子活力是一个极其复杂的农艺性状，是由基因控制的数量性状，同时还受到各种非生物胁迫的影响，如盐[1]、低温[2]等。Lin等[3]利用Nona Bokra和Koshihikari构建了F2及F3群体对水稻苗期耐盐性进行了QTL定位，共定位了11个影响8个耐盐相关性状的QTL，其中位于第7染色体中部检测到1个同时影响4个性状的QTL簇，这个QTL簇对地上部Na+含量效应最大，能解释表型变异的48.5%。水稻在受到低温胁迫时，细胞内主要有两类蛋白质分子在发挥作用：一类是直接保护细胞的渗透调节功能蛋白；另一类就是参与胁迫信号传导和表达调控的转录因子[4]，因此，揭示盐胁迫[5]和低温胁迫[6]下水稻种子萌发并形成正常幼苗的分子遗传激励，选育和利用高活力耐盐和耐低温水稻品种是解决水稻盐害和冻害最经济有效的方法，这已经成为水稻育种的一个重要目标。
种子活力是指在广泛的田间条件下，决定种子迅速整齐出苗和长成幼苗潜在能力的总称[7]。种子活力形成于种子发育的脱水阶段，随着种子成熟，体内的蛋白质、淀粉等物质逐渐积累，种子发芽率和活力逐渐提高，至生理成熟期达到高峰，此时，表现出最高的种子发芽率及活力[8]。高活力种子发芽早、出苗整齐且迅速，对不良环境的抵抗能力较强，具有明显的生长优势和生产潜力优势；低活力种子在适宜的生活条件下虽然能够发芽，但是发芽速度缓慢，在不良生活环境条件下出苗不整齐，有时甚至不出苗[9]。种子活力的高低是由遗传因素、种子发育期间的环境条件及种子贮藏条件3个方面共同决定，另外收获脱粒时的机械损伤也会对种子活力造成影响[10]。种子活力受到很多因素影响，是一个非常复杂的综合性状，表现在发芽率、苗长、根长、鲜重、干重等诸多方面[11]。目前，关于水稻种子活力已克隆了SKC1、OsVP1、qLTG31、Sdr4、OsFbx352和Qsd71/qPC7等7个基因，分别位于1、3、7和10等4条染色体上[12]。
以往研究结果表明太湖流域稻种资源韭菜青是强耐盐地方品种，以太湖流域粳稻品种韭菜青为材料，利用蛋白双向电泳技术，在150mM盐胁迫下筛选了不同萌发阶段显著差异表达蛋白。通过对差异倍数大于2的19个蛋白进一步进行质谱鉴定，其中一个蛋白由OsIPMS12基因所编码。该基因定位于水稻12号染色体上，因此本研究将该α异丙基苹果酸合酶基因暂命名为OsIPMS12。α异丙基苹果酸合酶（IPMS）是微生物亮氨酸和异撷氨酸合成途径中起催化作用的第一个酶，该酶不仅催化α酮异戊酸生成α异丙基苹果酸，并且α酮丁酸也是它的催化底物，对动植物生命活动都具有重要作用[13]。
本研究利用点突变材料，过量表达等转基因株系，对其正常条件及盐胁迫条件下的发芽速度及种子的根长和芽长进行鉴定。利用生物信息学方法分析其组织表达和发育过程中表达模式，从而初步分析了OsIPMS12在种子萌发过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料准备
前期实验室利用CRIPSRCas9技术构建了该基因的点突变体，通过农杆菌介导转化的方法获得OsIPMS12的过量表达转基因株系及启动子活性分析GUS转基因株系。经过筛选获得阳性纯合转基因株系T2代，同时选择35个稳定株系进行扩繁，收获成熟种子，储存于20 ℃冰箱，以备后期试验。
1.2 RNA的提取
提取RNA 所用的器皿、研钵、镊子等用酒精灼烧510 min，其他器皿均用0.1%的DEPC水处理后高温高压灭菌两次以去除RNA酶，所有试剂都保证没有RNA酶污染。
1) 1.5 mL离心管中加入1 mL Trizol，取0.1g组织在液氮中研磨至粉末，加入到Trizol中，立即充分混匀。（或保存在80℃，用时只要离心管中的液体融化完全）

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