近年来，新的组蛋白修饰不断被发现。水稻中组蛋白的赖氨酸巴豆酰化（Lysine crotonylation , Kcr）的研究还很少。本文利用染色体免疫共沉淀结合二代测序技术（ChIP-seq）揭示水稻全基因组Kcr的分布特征及其与基因表达调控的关系。近90%的Kcr位点分布在基因周围，其中genebody和启动子分别占约60%和30%。基因的表达模式与Kcr的富集呈正相关，即表达量越高Kcr越富集。Krc位点有关的基因显著影响多个代谢途径,包括氧化磷酸化、ATP的生成等。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 3
1．1 ChIPSeq技术 3
1．2 NGS技术 4
1．2．1 Illumina测序原理 5
1．3 材料 5
2 结果与分析 6
2．1 Fastqc软件 6
2．2 bowtie软件 6
2．3 MACS2软件 7
2．4 Kcr修饰位置与表达量的关系 8
2. 5 GO分析 9
3 讨论 13
致谢 14
参考文献 15
水稻巴豆酰化组蛋白修饰的全基因组分析
种子科学与工程 张琼
引言
引言
组蛋白是一种碱性小分子蛋白，易被生物大分子修饰，发生部位多在N末端的尾部[2]。图1中可以看出组蛋白修饰所发生的位点，精氨酸可以被甲基化修饰，赖氨酸可以被乙酰化、甲基化、泛素化修饰，丝氨酸和苏氨酸可以被磷酸化修饰，其中组蛋白赖氨酸位点的乙酰化和甲基化占很大比例，暗示赖氨酸上的这两种修饰在调节染色体结构以及基因表达上是非常重要的[3]。核小体由两个H2A，H2B组蛋白二聚体和两个H3，H4组蛋白二聚体组成的八聚体和146bp的DNA环绕1.75圈组成的。而核小体是染色质的结构单位，所以组蛋白被修饰会改变染色质的结构。随着组蛋白密码假说的提出，组蛋白修饰表现出复杂性。在对水稻全基因组组蛋白修饰的分析中，已发现了甲基化，乙酰化，巴 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
豆酰化等多种修饰及与发育，抗病功能的相关性。蛋白质翻译后修饰（PTM）随着蛋白质功能和生物学机制的成熟越来越重要。而赖氨酸巴豆酰（Kcr）化由2011年被发现是动物中发现的组蛋白修饰，动物中Kcr对基因表达有着正向效果。研究表明巴豆酰化也存在于植物中[1]，巴豆酰化对水稻有怎样的生物学功能需要探索，这种组蛋白修饰与基因表达有怎样的关系需要进一步研究。这些对研究发育、代谢、疾病等众多生理过程均有着关键作用。中国是世界上最大的水稻生产国,水稻种植面积和总产量分别占据世界的第二和第一位，水稻是世界主要粮食作物，也是单子叶植物研究的模式物种。随着表观遗传学的发展，进一步的研究水稻的组蛋白修饰和组合模式，对组合模式的功能进行分析对水稻育种等产业的发展具有重要的意义。


图1 不同组蛋白末端位点修饰类型[3]
Figure1 Different types of histone terminal site modification
1 材料与方法
1．1 ChIPSeq技术
染色质免疫共沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）是被广泛应用于研究DNA和蛋白质相互作用的方法。ChIP是一种在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法，可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化，能够得到转录因子（Transcription factors ，TFs)。近年来，ChIP成为在染色质水平研究基因表达调控的有效方法。ChIPSeq是ChIP技术结合NGS技术进一步确定染色质免疫共沉淀实验得到的DNA样品的序列。其序列可以通过直接测序确定[4]。
1．1．1 ChIP的原理
在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，以富集存在组蛋白修饰或者转录调控的DNA片段，再通过多种下游检测技术（定量PCR、基因芯片、测序等）来检测此富集片段的DNA序列。此步骤获得全基因组范围内与组蛋白或转录因子等DNA结合蛋白相互作用的DNA区段信息，这些DNA区段信息的长度大约为200 bp。用新一代的测序技术测序获得36~100 bp的DNA片段的序列，最后这些DNA片段将会被比对到对应的参考基因组上[5]。
1．1．2 ChIP步骤
染色质免疫共沉淀技术包括3个独立的步骤，即固定、沉淀和检测。第1步为固定，即在体内用甲醛（HCHO）固定DNA和蛋白质复合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手段将其随机切成一定长度的染色质小片段（200～1000bp）。第2步为免疫沉淀，即利用目的蛋白质或者目的蛋白质上标签的特异性抗体，通过抗原和抗体反应形成DNA－蛋白质－抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。第3步为目的片段的纯化与检测，即经过热处理解交联，释放共沉淀的DNA；再将DNA片段纯化后，对沉淀的DNA样品进行检测。如下图所示。
图2 ChIPseq工作原理[5]
1．2 NGS技术
NGS就是Next Generation Sequencing，又称“下一代测序技术”或者是“第二代测序技术”。相对于第一代测序Sanger其测序通量有了很大的提升，读长变短，需要打断测序，高效率，低成本。二代测序比较常见的有罗氏454测序，Illumina等。但目前最为常用的NGS技术就是Illumina测序技术，它能够保证在几十个小时内产生几百G甚至上T（1T=1024G，1G=1024M）的测序数据，完全能够满足高通量测序的通量要求。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/560732.html