：植物需要各类金属转运体来执行许多基本功能，包括对金属离子的吸收、转运以及储存。NRAMP（natural resistance-associated macrophage protein）同系物是一个进化中保存下来的二价金属转运蛋白，在金属离子的吸收转运及稳态平衡方面起着极为重要的作用。目前我们发现紫花苜蓿中也存在这此类基因，即NRAMP6基因，其编码的蛋白质可以影响金属离子在植物体内的运输与分布。本实验将紫花苜蓿中的NRAMP6基因作为研究对象，利用同源克隆技术，对紫花苜蓿维多利亚型（Medicago Sativa, cv. Victoria）苜蓿中的NRAMP6基因进行克隆，获得其碱基序列后研究其氨基酸序列的生物信息学特征，并尝试构建该基因的过表达载体，并且进一步分析该基因的诱导表达谱，对该基因的功能进行深入研究。主要的研究结果如下： 1.首先从维多利亚苜蓿中克隆到一条长为1687 bp的cDNA序列，该基因含有长为1629 bp的开放阅读框，起始密码子为ATG，共编码542个氨基酸。 2.利用生物信息学分析了MsNRAMP6的氨基酸序列同源性、疏水性、跨膜结构域等信息，并预测了该基因编码的蛋白质的二级结构以及其结构功能域，种种结果都证明该基因的确属于NRAMP基因家族。 3.MsNRAMP6在维多利亚型紫花苜蓿正常条件下、缺铁（-Fe）、缺锰（-Mn）处理下的表达谱分析，表明该基因在缺Fe诱导下的表达量大量增加，在缺Mn诱导下的表达量略有变化，说明该基因与Fe的转运有较大联系。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料与仪器设备.3
1.1.1 植物材料3
1.1.2 菌株、载体与试剂3
1.1.3 主要仪器设备4
1.2 维多利亚型紫花苜蓿NRAMP6基因的克隆与序列分析.4
1.2.1实验方案4
1.2.2 实验方法4
1.3 NRAMP6基因过表达载体的构建8
1.3.1 实验方案8
1.3.2 实验方法8
1.4 NRAMP6基因全长序列
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分析与氨基酸序列的生物信息学分析11
1.4.1 实验方案11
1.4.2 实验方法11
1.5 维多利亚型紫花苜蓿中NRAMP6基因在不同条件下的诱导表达12
1.5.1 实验方案12
1.5.2 实验方法12
2 结果与分析...14
2.1 MsNRAMP6基因编码序列的克隆14
2.1.1 根部总RNA的提取与cDNA的合成14
2.1.2 NRAMP6基因的PCR扩增、回收以及克隆14
2.1.3 NRAMP6基因的基因序列及序列分析16
2.2 MsNRAMP6基因过表达载体的构建19
2.2.1 重组质粒pMD19nramp6的获得19
2.2.2 重组质粒pMD19nramp6以及载体质粒pCAMBIA1302的提取与酶切结果20
2.2.3 获得重组质粒并转化进入大肠杆菌.22
2.3 MsNRAMP6基因的氨基酸序列片段的生物信息学分析结果22
2.3.1 氨基酸序列的理化参数性质22
2.3.2 氨基酸序列的疏水性/亲水性分析.22
2.3.3 氨基酸序列的跨膜结构域分析.23
2.3.4 蛋白质二级结构的预测23
2.3.5 蛋白质结构功能域的预测24
2.4 MsNRAMP6基因在不同处理下的诱导表达分析24
3 讨论25
3.1 关于MsNRAMP6基因克隆部分的分析25
3.2 关于MsNRAMP6基因序列和氨基酸序列的生物信息学分析部分的讨论26
3.3 关于MsNRAMP6基因诱导表达分析部分的讨论26
3.4 对于MsNRAMP6基因的总结讨论27
致谢27
参考文献27
紫花苜蓿NRAMP6基因的克隆与过表达载体的构建
引言
自工业革命以来，由于现代工业的迅速发展，工厂废弃物随意排放，农药与化肥甚至成为了农业过程中必需品，人类肆意掠夺资源，这种种不良因素的聚集，使得土壤中重金属的含量不断增加，现已成为全球性的问题。Fe、Mn等微量元素在很多的生命过程中都有着极为重要的作用，浓度过低时，会严重影响植物的生长过程；但浓度过高时，也会对其带来一定的伤害。Cd等重金属则具有更强的毒性［1］，植物中镉的存在会进入食物链而危害人类健康，植物在应对镉胁迫的同时，往往造成一些营养元素的缺乏，如Fe等［2］。
进入20世纪以来，对于植物铁素营养的研究一直是国内外植物营养学家的宠儿，其研究热点主要集中在：铁的生理功能、植物缺铁原因以及土壤铁胁迫的应对机理等［3］。铁是人们发现最早的微量元素，在地壳中含量极为丰富，主要以Fe2+、Fe3+的形态存在，可作用于植物的氧化还原反应，同时也参与植物一系列生命活动，如光合、呼吸、固氮、硝酸盐还原作用以及光合、呼吸作用中的磷酸化反应，甚至还与细胞分裂［4］、叶绿体的合成有关，对维持各种原核、真核生物的基础生命活动有着极为重要的作用［5］。由于土壤中的Fe大都以Fe3+的形态存在这，无法被植物吸收利用，且Fe的水溶性也较低，这使得植物经常处于缺铁环境下，大大影响植物的生长发育。因此，对植物铁胁迫的研究一直是现阶段植物学界的热点课题［6］。
目前，在植物对Fe吸收及转运机制方面的研究取得了很大的进展。研究表明，植物细胞中普遍存在着基本的氧化还原系统，这个系统分布在细胞质膜上，在植物吸收Fe的过程中十分重要［7］。植物应对缺Fe胁迫的机理有很多种，其中比较有说服力的有两种，一种是由还原性物质分泌系统、质子分泌系统以及铁还原酶系统三部分组成，主要原理为将Fe3+还原后促进植物的吸收［8］；另一种则是利用植物中的重金属转运蛋白，提高植物对铁的吸收能力，从而改善植物的缺铁症状。
目前发现， NRAMP家族基因可以编码影响植物体内Fe运输的蛋白质，且该基因具有很高的保守性，本课题通过对该基因的编码序列进行克隆，并尝试进行过表达载体的构建，分析该基因的诱导谱，进一步探讨植物对缺Fe胁迫的响应方式，从而为缓解缺Fe胁迫对植物的影响提供理论基础。
自然药代动力学巨噬细胞蛋白质（natural resistanceassociated macrophage protein，NRAMP）是进化中保存下来的二价金属转运蛋白［9］，广泛存在于细菌、酵母、果蝇、植物以及人类体内［10］。NRAMP基因家族首先是在动物体内被发现并克隆的，1991 年首次在小鼠中发现Nramp基因家族，并相继鉴定了人体内的3个NRAMP基因［11］。水稻中存在至少3个以上的OsNRANP基因；而在拟南芥中则存在6个AtNRAMP基因，1、2、6号定位于1号染色体上，AtNRAMP 3、AtNRAMP 5、AtNRAMP 4分别定位于2号、4号和5号染色体上［12］。
NRAMP基因家族首次被发现并克隆是在动物中，因此报道大多集中于动物体内， 但是，国内的相关报道较少。植物中关于NRANP基因据报道多在水稻和拟南芥等中，该基因家族在植物中的作用大都与Fe的吸收、转运有关［13］；但是也有一些家族成员表现出较为宽泛的金属吸收转运功能，例如Fe2+、Mn2+、Cd2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Pb2+等［14］。

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