胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp．carotovorum，简称Pcc)能引起多种植物的细菌性软腐病。其寄主广泛，防治比较困难。目前，与Pcc 致病相关的各种植物细胞降解酶的产生、调节、分泌及相应的表达基因虽然已经得到了一定的研究，但与代谢相关的酶及其与致病性之间的关系的研究尚少。天冬氨酸氨裂解酶(AspA)催化L-天冬氨酸转化为延胡索酸和氨的去氨基过程，该酶广泛存在于细菌中。本研究通过同源重组法成功构建AspA编码基因缺失突变体∆aspA(2)和双敲除缺失突变体∆aspA(1/2)，并进行致病性试验，结果显示两株突变体与野生型相比，对寄主白菜的致病性均无显著的差异，说明aspA(2)和aspA(1/2)的缺失突变并不影响菌株PccS1的致病能力。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言1
1材料与方法2
1.1供试菌株和质粒2
1.1.1菌株和质粒2
1.1.2 菌株培养条件及保存2
1.2 培养基和抗生素2
1.2.1培养基3
1.2.2抗生素5
1.3 试验试剂及器材3
1.3.1 试剂3
1.3.2 引物3
1.3.3 器材3
1.4 试验方法3
1.4.1 重组自杀载体的构建3
1.4.1.1 aspA基因上下游片段及Km片段的克隆3
1.4.1.2 片段连接4
1.4.1.3 热转感受态细胞的制备4
1.4.1.4 热激转化4
1.4.1.5重组质粒提取5
1.4.2 两亲交配筛选突变体5
1.4.3 白菜致病性试验6
2 结果与分析6
2.1 重组载体的构建6
2.2 突变体筛选及验证6
2.3 白菜致病性8
3讨论9
致谢9
参考文献10
胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种aspA基因功能研究
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/> 引言
胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种为革兰氏阴性细菌[1]，是多种植物细菌性软腐病的病原菌[2]，而细菌软腐病是一种极为常见也是危害严重的世界性重要细菌性病害之一，在我国曾引起过园艺作物的严重经济损失[34]。引起此类病害的主要病原菌有：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种 (Pcc，1998年前为Erwinia carotovora subsp. carotovora)、胡萝卜软腐果胶杆菌黑胫亚种 (Pectobacterterium carotovorum subsp. atroseptica， 1998年前为E. carotovora subsp. atroseptica) 和菊欧文氏菌 (Dickeya dadantii，1998年前为 E. chrysanthemi) [57]。Pcc菌体呈棒状，大小0.51.0×2.23.0 μm，无荚膜，单生或具26 根周生鞭毛，不产生芽孢[8]。兼性厌氧，生长温度237 ℃，最适温度2528 ℃，菌株在超过50 ℃时无法存活。pH 5.39.2均可生长，最适为7.2；光照、干燥不利于其存活，在太阳光下曝晒2 h会让大部分菌株死亡。脱离寄主，可于土壤中单独存活约15天[910]。普通肉汁培养基培养，其菌落呈灰白色，半透明状，表面较光滑，微微凸起，圆形或不定形，边缘整齐。Pcc引起的软腐病一直都是植物病理学研究的重要内容之一，尤其是在其全基因序列公布后，与其致病相关的研究更有所增加[11]。Pcc寄主广泛，包括大白菜、马铃薯、马蹄莲和胡萝卜等，也能引起多种水果蔬菜贮藏期腐烂[12]。病状随寄主和外界条件的差异而略有变化，一般来说，柔嫩多汁的组织更易受到侵染，呈水浸半透明状，在病斑边缘有明显的界限，后随病势发展病组织软化，病斑变为褐色，且病健交界限逐渐模糊，出现腐烂并伴随恶臭味，待水分蒸发后，组织干缩[13]。
天冬氨酸氨裂解酶(AspA)是催化L天冬氨酸转化为延胡索酸和氨的去氨基可逆过程的酶。该酶广泛存在于细菌中，包括大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、荧光假单胞菌、枯草芽胞杆菌等[14]。其对细菌氮代谢具有重要作用[15]。目前天冬氨酸氨裂解酶的研究大多以大肠杆菌为主，对于Pcc中天冬氨酸氨裂解酶的研究较少。本实验室前期研究以LB培养基培养、与黄花马蹄莲离体及活体互作的Pcc为研究对象，并运用双向电泳技术、质谱技术及ImageMaster 2D platinum 5.0 软件对这三种条件下的Pcc差异表达蛋白质进行比较分析。结果发现共有53个蛋白在这两种互作方式下表达量不同程度的改变，而天冬氨酸氨裂解酶正是差异表达蛋白之一，其在Pcc与黄花马蹄莲离体和活体互作两个条件下与LB培养的Pcc相比均上调表达[16]。在PccS1基因组中，编码AspA的基因只有PccS1_0596和 PccS1_1157。本研究利用基因敲除，获得基因单敲除缺失突变菌株和双敲除缺失突变菌株，对天冬氨酸氨裂解酶在Pcc致病过程中的作用进行初步研究分析。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和质粒
1.1.1菌株和质粒
本研究所涉及的菌株、质粒见表1。
表1 本实验所需菌株及质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
Strains and plasmids
Characteristics
Source
Escherichia coli
Top10
Standard cloning host
Lab collection
S171λpir
λpir pro hsdR, recA
Lab collection
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
PccS1
Wild type, RifR
Lab collection
∆aspA(1)
RifR , The aspA(0596) gene knockout mutant of strain PccS1
Lab collection
∆aspA(2)
RifR , KmR , The aspA(1157) gene knockout mutant of strain PccS1

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