目录
摘要Ⅱ
关键词Ⅱ
AbstractⅢ
Key wordsⅢ引言1
1 材料与方法3
1.1 植物材料 3
1.2 菌株、质粒和试剂盒 3
1.3 总RNA的提取及cDNA第一链的合成3
1.4 诱饵载体的构建4
1.4.1引物设计与合成4
1.4.2 P15基因序列的PCR扩增4
1.4.3 PCR产物的回收与纯化5
1.4.4 回收产物与pGBKT7/pGADT7载体的连接5
1.4.5 重组载体转化与菌液PCR鉴定5
1.5 诱饵载体pGBKT7P15对报告基因的自激活检测5
1.6 诱饵载体pGBKT7P15与pGADT7P13一对一互作验5
1.7 半乳糖苷酶活性测定6
2 结果与分析6
2.1 P15基因的克隆和pGBKT7P15诱饵载体的构建6
2.2 P13基因的克隆和pGADT7P13猎物载体的构建7
2.3 pGBKT7P15诱饵载体的自激活检测8
2.4 P15与P13一对一互作验证9
3 讨论10
致谢 11
参考文献 12
粳稻地方品种黑壳子粳抗稻瘟病基因P15互作蛋白鉴定
摘 要
水稻是一种至关重要的粮食作物之一，世界上超过一半的人口以水稻为主食。稻瘟病是水稻的重要病害之一，严重时可引起水稻减产高达50%，每年因稻瘟病损失的粮食产量足以养活至少6,000万人口，对各个稻区或水稻生产国造成粮食生产和粮食安全等方面的威胁。由于稻瘟病生理小种的多态性和易变性，许多投入大田生产的水稻抗稻瘟病品种往往在推广23年以后便失去抗性，因此，挖掘高效、广谱、稳定的抗病基因，分析和验证抗病基因所具备的功能，探究抗病反应机制对培育良好的抗病品种具有重要意义。
P15是实验室前期在粳稻地方品种黑壳子粳中定位到的一个具有广谱抗性的稻瘟病抗性基因，与感病材料苏御糯中的等位基因相比，其序列存在较大差异。P15属于NBSLRR类基因，其蛋白序列含有NB *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
ARC结构域及富亮氨酸重复序列，其CDS全长序列4086bp。为进一步研究基因的功能，本研究利用酵母双杂交系统进行其互作蛋白的筛选鉴定，最终发现P15蛋白与转录因子类蛋白P13存在互作效应。这也为今后深入开展P15的功能及其介导的水稻抗稻瘟病作用机制研究提供了参考依据。
引言
水稻（Oryza sativa）是一种至关重要的粮食作物之一，世界上超过一半的人口以水稻为主食（杜轶威, 2016）。水稻在全球范围内广为种植，其耕地面积占总耕地面积的9％。预计到2030年，水稻年产量需在目前的基础上增长40%才能满足世界人口激增带来的粮食生产与粮食安全问题（Khush, 2005）。然而，许多生物胁迫因素（病害、虫害、杂草危害）始终影响着水稻的高产、稳产、高效问题。稻瘟病是作物界的重要病害之一，由子囊真菌（Magnaporthe oryzae）引起，可造成大幅度减产，严重时减产40%50%，甚至颗粒无收（Dean, 2012）。稻瘟病是一种世界性病害，在全球的水稻生产国及种植区范围内都在不同程度的影响，具有局部发生、发生范围广、危害重的特点，造成的经济损失和产量损失足够养活六千万人口（Takan, 2012）。在亚洲和非洲，稻瘟病对水稻生产的影响尤为严重，给粮食安全带来隐患。20世纪90年代以来，我国尤其是东北、西南、长江中游地区，稻瘟病年发生面积高达330570万公顷，由此造成的稻谷损失超过10亿公斤（刘凯等, 2015）。在东印度一带，水稻每年因稻瘟病的侵害损失惨重，高达50%左右。除此以外，日本、韩国等国家亦是稻瘟病高发地区。因此，通过降低稻瘟病发生率和预防稻瘟病来解决这一重大灾害，对于解决水稻产量稳定和粮食安全问题都发挥着关键作用（Deng et al., 2017）。实践证明，由于稻瘟病菌小种的多样性和易变性，短周期稻瘟病抗性品种已成为制约水稻生产的主要障碍之一。因此，选育并培养对稻瘟病具有持久和广谱抗性的新型水稻品种是防治稻瘟病最经济环保有效的方法之一。
实验室早期在粳稻地方品种黑壳子粳第11号染色体长臂末端定位并克隆到了一个对稻瘟病具有广谱抗性的基因P15。前期对P15的CRISPR/Cas9突变体材料的抗性鉴定结果显示，P15的突变会使抗稻瘟病水稻品种黑壳子粳变得感病；P15过表达转基因材料的抗性对比感病受体苏御糯显著增强。P15基因组序列长度为8331bp，编码1361个氨基酸，包含1个NBS（核苷酸结合位点）LRR（富含亮氨酸结合序列）蛋白结构域（何弯弯, 2016; 李梦雅, 2019）。目前已被成功克隆的37个抗稻瘟病基因编码蛋白类型可大致分为五类，其中大多数编码NBSLRR类蛋白，另外还有编码含有四肽重复序列蛋白的bsrk1基因，为对稻瘟病具有光谱抗性的隐形基因（Zhou et al., 2018）；编码含有四个Armadillo重复区的ptr基因（Zhao et al., 2018）；编码含有一个B型凝集素的跨膜受体蛋白激酶的显性基因Pid2，其具有生理小种专化抗性（Chen et al., 2006）；编码C2H2型转录因子的bsrd1（Li et al., 2018）；以及编码富含脯氨酸的金属结合蛋白的非小种专一性隐性抗性基因pi21（曹妮等, 2019）。水稻中已经报道的多个NBSLRR类稻瘟病抗性基因，许多都依赖于两个或多个蛋白共同发挥作用（Tameling and Joosten, 2007）。水稻中，经过序列分析及转基因功能验证后发现Pi5与Pikm类似，其发挥作用需要两个独立遗传且转录方向相反的NBSLRR基因Pi51和Pi52，且两个基因编码的蛋白产物在氨基端均含有CC结构域（Lee et al., 2009b）。类似地，Pik也同样需要Pik1和Pik2共同发挥作用（Kanzaki et al., 2012）。Pia是位于水稻11号染色体已被克隆的稻瘟病抗性基因，其编码的两个临近的NBSLRR类抗性蛋白RGA4/RGA5通过直接结合的方式识别稻瘟病效应子AVRPia和AVRCO39，从而介导了对稻瘟病的抗性途径（Cesari et al., 2014）。由此可见，稻瘟病抗性机制是一个十分复杂的网络通路，因此，挖掘新的稻瘟病抗性基因、对其功能进行分析验证、揭开其介导的抗病反应通路是抗性育种发展中必不可少的理论基础。

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