目录
摘 要 II
关键词 II
ABSTRACT III
KEY WORDS III
引言 1
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.2 方法 4
1.2.1 表型分析鉴定 4
1.2.2 突变体和野生型种子蛋白的提取与SDSPAGE分析 4
1.2.3 水稻胚乳透射电镜制 7
1.2.4 突变体的SSR标记初定位与精细定位 7
2 结果与分析 10
2.1 表型鉴定 10
2.1.1 外观表型鉴定 10
2.1.2 SDSPAGE胶鉴定 10
2.1.3 电镜观察 11
2.2 基因初定位与图位克隆 12
3 讨论 13
致谢 14
参考文献 15
水稻谷蛋白前体积累突变体F968的遗传分析与基因定位
摘 要
水稻（Oryza sativa L.）是世界上重要的粮食作物之一，全世界有近一半人口以稻米为食。贮藏蛋白作为稻米中第二大类营养物质，其含量和组成直接影响稻米的各项指标和营养价值。水稻谷蛋白含量占总贮藏蛋白的80%左右，其合成分选受一系列复杂的过程调控，期间调控转运过程的重要功能因子的突变都有可能影响稻米蛋白品质，因此对水稻谷蛋白分选调控路径的研究具有重要的意义。谷蛋白以57kDa的形式在内质网合成，接着通过蛋白分选途径运输至蛋白贮藏液泡PSV中，并在这里剪切为成熟的酸性和碱性亚基。本文研究材料F968具有粉质胚乳的表型，通过蛋白质SDSPAGE发现其谷蛋白前体增加，并且相应的酸碱性亚基含量减少。本研究对该材料进行了表型鉴定与基因的克隆，以期发掘调控谷蛋白合成与分选相关的新基因，为谷蛋白转运的分子网络提供帮助。
引言
水稻（Oryza sativa L.）是禾本科重要的模式作物，并且是全世界重要的粮食作物之一。全世界有90%的水稻生产自亚洲，据统计稻米为亚洲人提供了将近1/3的蛋白质含量，因此稻米也是亚洲人重要的蛋白质营养来源[1]。
水稻种子中积 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
累了大量的贮藏蛋白，其中包括谷蛋白（glutelin）、 醇溶蛋白(prolamin)以及球蛋白(αglubolin)，这些物质为水稻种子的萌发以及幼苗的生长提供了营养[2]。在水稻贮藏蛋白中，谷蛋白的含量最高，占到了总蛋白含量的80%左右。水稻谷蛋白富含赖氨酸等人体必需氨基酸，对食味品质负面影响较小，并且很容易被人体消化吸收，相反，醇溶蛋白因为有着致密的结构，很难被人体消化吸收并且对稻米食味品质有着负面的影响。因此这也为未来的水稻育种点明了一个方向：通过提高水稻谷蛋白含量，并且降低醇溶蛋白的含量，可以在不改变甚至提高稻米的营养价值的前提下来改良稻米的食味品质[1]。
水稻谷蛋白首先以57 kDa的形式在粗面内质网（rough endoplasmic reticulum， RER）上合成，合成的前体经由致密囊泡（dense vesicles, DVs）介导的途径经由高尔基体转运进入蛋白体Ⅱ（protein body Ⅱ,PBⅡ）中，PBⅡ是一种蛋白贮藏液泡（protein storage vacuole, PSV）。接着前体在PBⅡ中被剪切成为成熟的酸性亚基和碱性亚基，其中酸性亚基大小在3739 kDa，碱性亚基大小在1920kDa。如果上述过程中的任何一个步骤出现问题，胚乳细胞中会积累57 kDa的谷蛋白前体蛋白[3,4,5]。我们把这种水稻突变体统称为57H突变体，对57H突变体的研究有助于分析控制水稻种子贮藏蛋白质运输和加工的分子机制[6][7]。
到目前为止，一共有11种水稻谷蛋白57H突变体被报道，包括gpa1/glup4, gpa2/glup6, gpa3, gpa4/glup2, gpa5,gpa6,W379/glup3, esp2, glup1/esp5,Glup5, and glup7[821]。
胚乳贮藏蛋白突变体2(ENDOSPERM STORAGE PROTEIN MUTANT2, ESP2)编码一种蛋白质二硫键异构酶(PROTEIN DISULFIDE ISOMERASELIKE protein，PDI)， esp2种子发育不正常，并且经SDSPAGE检测谷蛋白前体积累量显著增加，电镜观察发现esp2突变体内出现内含谷蛋白前体的新型蛋白体，前体通过二硫键与富半胱氨酸（Cys）的醇溶蛋白聚集在一起。研究表明esp2突变体内PDI发生异常，导致内质网胁迫，从而造成谷蛋白分选途径发生异常[8]。
谷氨酸前体突变体3（GLUP3）编码一种液泡加工酶1（VACUOLAR PROCESSING ENZYME1，VPE1），OsVPE1是拟南芥βVPE的同源基因，核苷酸序列分析发现W379发生一个错义突变，将269位的半胱氨酸（Cys）突变为甘氨酸（Gly）。和野生型相比，虽然突变体W379可以讲蛋白正确分选到液泡中，但是OsVPE1的酶活完全丧失。进一步研究发现，OsVPE1的错误剪切，导致突变体中成熟的蛋白体在外观上显著小于野生型。综上所述，OsVPE1是一种半胱氨酸蛋白酶，它在水稻谷蛋白成熟过程中发挥重要作用。谷蛋白前体的液泡加工需要OsVPE1，且Cys269是关键残基，对维持OsVPE1的酶活性至关重要[11]。
gpa1（glutelin precursor accumulation1）突变体种子胚乳呈现粉质不透明的表型，并且伴随着57 kDa谷蛋白前体的显著增加。透射电镜分析超微结构发现突变体的胚乳细胞中内质网腔增大，二型蛋白体PBⅡ体积显著减小，并且出现了3种新型的亚细胞结构。进一步研究发现，gpa1中有一部分谷蛋白并没有被正确分选至蛋白体PBⅡ中，而是被错分配至新型的结构或者分泌物中。图位克隆表明OsRab5a的突变导致了这样的表型。OsRab5a编码一个小G蛋白，因此OsRab5a在蛋白向PBⅡ运输通路中发挥重要作用[9][16]。

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