目录
摘要 I
关键词 I
ABSTRACT II
KEY WORDS II
引言 1
1 材料与方法 4
1.1 植物材料 4
1.2 载体、菌株和主要试剂 4
1.3 实验方法 4
1.3.1 荧光定量分析 4
1.3.2 基因克隆 6
1.3.3 过表达载体构建 7
1.3.4 亚细胞定位 7
1.3.5 拟南芥遗传转化 8
1.3.6 大豆发根遗传转化 9
1.3.7 转基因拟南芥的表型分析 10
1.3.8 无机磷（Pi）含量的测定 10
1.3.9 总磷（P）含量的测定 10
2 结果与分析 11
2.1 GmSPX8基因在低磷胁迫处理大豆中的表达模式分析 11
2.2 GmSPX8基因的克隆 12
2.3 GmSPX8基因的亚细胞定位 12
2.4 过表达GmSPX8转基因拟南芥的表型分析 13
2.5 过表达GmSPX8转基因拟南芥的无机磷（Pi）含量分析 14
2.6 农杆菌介导大豆发根的总磷（P）含量分析 15
3 讨论 15
致谢 17
参考文献： 17
大豆磷平衡相关基因GmSPX8的克隆和功能分析
摘要
大豆是世界上重要的粮食作物和经济作物，由于其蛋白质等含量丰富，故颇受人们的喜爱。磷是植物必需的大量元素之一，对大豆的生长发育和产量都具有非常重要的作用。然而，土壤中有效磷含量低是限制当前大豆生产的重要因素之一。已有研究表明，大豆基因组中GmSPX3的表达受低磷条件的诱导，且表达量随磷含量变化而变化。因此，本研究以GmSPX家族另一成员GmSPX8为研究对象，以Williams 82大豆为实验材料，通过荧光定量分析、基因克隆、亚细胞定位对该基因进行初步分析，再通过遗传转化拟南芥和大豆发根等实验对其进行功能分析。实验发现在低磷条件下，GmSPX8基因对拟南芥和大豆 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
的根系发育和磷含量吸收具有正向调控作用，根系是大豆对低磷胁迫产生响应的重要器官。本研究为大豆耐低磷调控分子机制的研究奠定了基础，为大豆提高磷利用效率提供了基因资源。
引言
大豆是世界非常重要的粮油兼用作物，是人类优质蛋白及畜牧业饲料蛋白的主要来源，在农业生产中具有非常重要的地位。作为需磷量较大的农作物，大豆籽粒含磷量远远高于水稻和玉米[1]。磷元素参与了大豆的整个生育期：在营养生长期间，大豆从土壤中吸收到的磷元素都积累在叶片中；进入到生殖生长阶段，磷元素主要转移积累到大豆荚果中以确保籽粒能够饱满成熟[2]。由于大豆的根瘤菌具有固氮作用[3]，磷素已成为大豆生长及产量最重要的限制性元素。磷的缺乏不仅会影响大豆的生长发育，增加花荚的脱落，还会抑制根瘤的形成，降低固氮效率，最终严重影响大豆的产量和品质。因此，低磷胁迫已经成为当前影响我国大豆生产的重要限制因素。
然而，世界43%的土壤处于缺磷状态，我国约有三分之二的土壤缺磷[4]。虽然土壤中的磷元素总含量很高，但由于大部分磷被土壤中的Fe3+、Al3+、Ca2+等金属离子固定，或被土壤交替吸附，多以植酸磷形式存在[5]，因此，能被植物吸收利用的有效磷含量极低，常被称为土壤中磷的“遗传学缺乏”[6]。施用磷肥可以增加植物对有效磷的吸收，但其对于环境的污染以及磷肥资源短缺，使得这一方法不可长期应用[78]。因此，深入了解大豆应对低磷胁迫的适应机制、快速发掘利用优异耐低磷基因、通过分子育种选育磷高效利用大豆新种质是解决土壤有效磷含量低这一问题的有效途径
1、大豆植株缺磷后的症状表现
大豆植株缺磷后会表现出明显的症状，并严重影响其产量和品质。Howell等提出[9]，大豆缺磷会出现植株变矮、叶片变小、下部叶片出现坏死斑点的症状；研究发现，大豆结荚期缺磷将会导致植株矮小，上部叶片变小且颜色呈现暗绿，下部叶片变黄、脱落 , 花期延迟，结荚变少[3]。有研究通过观察150多份大豆材料在缺磷条件下的症状表现[10]，发现缺磷条件下，大豆植株表现出叶片变小、茎色发紫、下部叶片出现黄色并伴有坏死斑点、根系变褐、植株生长速度变缓、株高变矮 、单株结荚数量减少等症状；同时考察植株地上部、根系干重相对值 (低磷干重 /适磷干重 )可发现，相对值分别为0.43～0.91(地上部平均值0.65, 差异可达2.12倍 ), 0.49～1.15(根系平均值0.82，差异可达2.12倍)。
2、包含SPX结构域的蛋白
在低磷响应相关基因的研究中，SPX结构域在酵母和植物的无机磷传输蛋白与信号传递蛋白中都有被发现[11]。SPX结构域是酵母Syg1，PHO81和XPR1人类蛋白三个基因在其N末端都有一个180个氨基酸残基的同源性，故用其首字母缩写而成。在含有SPX结构域的众多基因中，SPX亚家族的基因被证实在维持磷的内环境稳定中具有极其重要的作用。在水稻中，SPX家族包含六个成员，即OsSPX1，OsSPX2，OsSPX3，OsSPX4，OsSPX5，OsSPX6[1214]。其中，OsSPX1，OsSPX3，OsSPX4，OsSPX5已被提议为几个Pi饥饿反应基因的转录负调控因子。OsSPX4突变体中PSI基因的表达量显著提高，并且伴随着植物总磷含量大幅提高。通过酵母双杂交等实验发现OsSPX4可以与OsPHR2互作，并且在全磷环境下OsSPX4可以抑制OsPHR2的活性，但在低磷环境下OsSPX4却会被降解失活[15]。研究发现，OsSPX1和OsSPX2也有类似的作用，在全磷环境下OsSPX1和OsSPX2与OsPHR2是高亲和的，而在低磷环境下OsSPX1/OsSPX2与OsPHR2则变为低亲和的[16]。

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