铜是植物生长所需的元素之一，但高浓度的铜会对植物造成危害。茶叶当中儿茶素是重要的次生代谢物，其生物合成途径涉及许多酶基因的调控。本文利用‘白叶1号’茶树品种作为实验对象，探究铜胁迫处理不同天数对儿茶素合成相关酶基因表达量的影响，利用荧光定量PCR检测发现用同一浓度的CuSO4溶液处理茶树不同时间，肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)、黄烷酮-3’-羟化酶(F3’H)、黄烷酮-3’，5’-羟化酶(F3’5’H)以及二氢黄烷酮-4-羟化酶(DFR)基因的表达量都有所下降，但各个基因下降的程度不同，同一基因在处理不同时间下表达量也不同。其中F3’5’H、C4H和DFR下降程度最大，处理不同时间下几乎全部基因的表达都有差异，推测铜胁迫会下调茶树儿茶素合成相关基因的表达，影响儿茶素的含量。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1．材料与方法 6
1.1.实验材料 6
1.2实验试剂 7
1.3实验仪器 7
1.4实验方法 7
1.4.1胁迫处理 7
1.4.2基因克隆 7
1.4.3荧光定量PCR 8
2.实验结果及分析 9
2.1RNA凝胶电泳检测 9
2.2儿茶素合成相关酶基因的表达情况 10
3.讨论 11
致谢 12
参考文献 12
铜胁迫对儿茶素合成相关基因的影响
引言
引言
立题背景及意义
化肥、农药的大量施用，高度工业化对农业生产带来了较多的副作用，如环境污染严重、土壤肥力下降、重金属积累、农药残留超标等。因此人们开始意识到农业可持续发展的重要性，开始提高对食品安全的重视程度，重金属污染这一问题也得到了更多的关注。
据Park.j.h等的文中所述，重金属常指原子密度大于6g/cm3的金属与类金属元素（排除砷As、硼B、硒Se），其包括生物的必需与非必须元素，在高浓度情况下它们对于植物、动物以及人类都有毒[1]。如镉 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
，据杨红霞等所述一方面镉会影响植物的生长和发芽率，对根系产生毒害。另一方面又影响植物生理活动，如影响光合、呼吸作用，破坏酶的活性等[2]。土壤是重要的自然资源，土壤重金属污染主要是指其中金属元素超过了其可以承受的最大值而造成污染的现象[3]。作为农产品生产的载体，土壤理化性质和质量水平都会对作物产生一定的影响。
茶叶是世界三大饮料之一，铜是茶树生长发育所必需的元素。儿茶素是茶叶中黄烷醇的总称，在茶多酚中占到总量的70%，目前儿茶素的合成途径已基本明确，有莽草酸途径、苯丙酸盐途径和合成儿茶素三步。涉及的主要酶类有肉桂酸羟化酶（C4H）、查尔酮异构酶（CHI）、黄烷醇3羟化酶（F3H）、类黄酮3’羟化酶（F3’H）、类黄酮3’,5’羟化酶（F3’5’H）、二氢黄酮醇4还原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）等
目前已有很多植物克隆分析了这些酶的基因，所做的环境胁迫研究也主要是光、温度、蔗糖、激素等，而重金属胁迫特别是铜胁迫下它们的表达情况却知之甚少。本文在前人对这些基因所作研究的基础上利用高浓度铜处理茶苗，克隆基因，研究其表达情况，为茶树中多酚物质对铜的响应提供理论基础。
拟解决主要问题
（1）在给定的铜浓度下所研究的相关酶基因可以被诱导表达；
（2）能有效准确克隆得到相关基因
（3）能利用荧光定量PCR检测到目的基因的表达。
铜胁迫对茶树的影响
铜是许多酶的组成成分，如多酚氧化酶，细胞色素氧化酶、酪氨酸酶等，此外还影响光合和呼吸作用，影响蛋白质及碳水化合物的合成，参与氧化还原[4]；同时也作为叶绿体中质体蓝素的组分参与光合作用的电子传递过程[5]。故铜含量会对茶树的生长和生理产生作用。
茶树缺铜叶片会出现病斑，造成叶片失绿，叶缘坏死，但主脉仍为绿色。李晓林等用水培和盆栽试验研究铜胁迫下对茶树的影响表明：盆栽试验下茶树主干、侧枝粗度、株高、枝梢长度及发芽数都显著降低，且铜浓度越高降低越多。水培试验下茶树上部叶尖焦枯，中下部叶片逐渐干枯萎蔫，后会大量脱落；当浓度达到12mg/L时会使叶片焦枯变褐，培养时间延长甚至会造成死亡[6]。
王海斌等用不同浓度的铜处理铁观音和肉桂两种茶树，发现铜含量在根部最高，其次是叶片，茎部最少；还发现铜胁迫下两种茶树不同组织中可交换态铜、铁锰氧化态铜、有机结合态铜等含量增加，但不同品种中各种状态铜含量有所差异[7]。同时李晓林等的研究也指出茶树中铜含量累积最多的地方是吸收根，其次为主根、枝条、主茎、新稍，最少的是叶片[6]。
Saha, D等用铜处理TS520和TS462两种茶树的叶片发现一定铜浓度下脂质过氧化加深，叶绿素减少，酚类化合物和POD、SOD、CAT含量增加，这表明铜浓度增加导致叶片活性氧产生，茶树通过诱导产生酚类和过氧化酶降低活性氧含量[8]。王娅玲等对大叶种茶树幼苗研究表明：铜浓度在0~30mg/L范围内，SOD、CAT及POD活性先升后降，在5mg/L时比对照组升高，10mg/L时下降，丙二醛的含量却有所增加，这表明铜胁迫下大叶种茶树体内抗氧化酶的合成受阻[9]。
韩文炎等用叶面施铜和土壤施铜处理茶树新稍、生产枝、成熟叶及主根和吸收根发现土壤施铜可明显降低茶树对磷、锌的吸收；对于锰不管哪种方式都会使新稍及成熟叶中含量增加；对于铁叶面施铜总体上会降低其含量，土壤施铜则可以改变铁的积累和分布部位；而钾、钙、镁及钠都是在叶面施铜时含量增加，土壤施肥时含量降低[10]，这表明铜的含量会影响茶树对其他矿物元素的吸收，破坏体内矿质营养的平衡。
茶树适宜在酸性土壤中生长，但不当的栽培管理措施或自然原因、环境问题等会造成茶园土壤的酸化，酸化土壤容易使铜离子的活化度增加[11]，茶树根系对铜的吸收增加，受胁迫的程度增大。因此要妥善处理茶园中铜施用问题，避免高浓度铜造成的危害。
儿茶素相关酶基因
多酚指广泛存在于植物体内，含多个酚羟基的天然化合物。类黄酮是一类低分子量的多酚次生代谢物[12]，拥有所有多酚类的共性，如抗氧化性，清除自由基等。由于其母体可以不同变化，故在结构上可分为若干类：黄酮，黄烷酮，黄酮醇，黄烷酮醇，黄烷醇，花青素等。茶叶中类黄酮含量较高，总量大概占干重的20~30%，花青素是一类水溶性的色素，是植物中的主要呈色物质，在已知的20种花青素中天竺葵素、矢车菊素和飞燕草素是茶叶中主要成分[13]。儿茶素是茶叶中黄烷醇的总称，在茶多酚中占总量的70%，是其重要的组分。目前儿茶素的合成途径已基本明确，分为莽草酸途径、苯丙酸盐途径和合成儿茶素三步，如图11。其中涉及的主要酶类包括：苯丙氨酸解氨酶PAL、肉桂酸羟化酶C4H、查尔酮合成酶CHS、查尔酮异构酶CHI、黄烷醇3羟化酶F3H、类黄酮3’羟化酶F3’H、类黄酮3’,5’羟化酶F3’5’H、二氢黄酮醇4还原酶DFR、花青素合成酶ANS等。

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