儿茶素是茶树体内重要的活性物质，对重金属镉胁迫有重要的作用。但是镉胁迫下儿茶素合成相关基因的研究尚不充分。本文以‘白叶一号’茶树为实验材料，喷施30mM CdCl2溶液，在处理后第1、3、5天分别测定处理组（Cd）和对照组（CK）中C4H（反肉桂酸4-羟化酶）、F3H（黄烷酮3-羟化酶）、F3’H（类黄酮-3’-羟化酶）、F3’5’H（3’，5’-类黄酮羟化酶）、DFR（二氢黄烷醇4-还原酶）、ANS（花青素合成酶）这6个儿茶素合成相关基因的表达量，进而研究镉胁迫对儿茶素合成基因的影响。实验发现，处理组 C4H、F3’5’H、ANS 、F3’H的表达量随时间下降，F3H、 DFR的表达量先上升后下降。与对照组相比，处理组的C4H、F3’5’H、ANS的表达量显著低于对照组，F3’H、F3H的表达量在第1、3天均显著高于对照组（p<0.05）。C4H为苯丙烷代谢途径关键酶，结果证明镉胁迫影响苯丙烷代谢途径。F3’5’H是合成EGC（表没食子儿茶素）、EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）的关键酶，其表达量的显著下降证明镉胁迫对EGC和EGCG的合成影响较大。这为进一步研究茶树体内对于镉胁迫的响应机制，以及镉胁迫对活性物质儿茶素的合成相关基因表达的影响提供了基础和思路。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 4
1．1 实验材料 4
1．1．1 实验试剂 4
1．1．2 实验仪器 5
1．2 实验方法 5
1．2．1 茶树总RNA提取与质量检测 5
1．2．2 单链cDNA的合成 5
1．2．3 荧光定量PCR 6
1．2．4 数据分析 7
2 结果与分析 7
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
镉胁迫下茶树儿茶素合成相关基因的表达分析
引言
引言
我国主要产茶大省为四川、云南、湖南、贵州等，这些主要产茶省同时也是镉矿资源丰富、镉矿开采较为频繁的地区，在开发利用镉矿的过程中，镉污染通 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
过水体、土壤、大气等各种传播途径，不可避免地会对周边生态产生威胁，已有大片土地受到了严重的镉污染[1]。
镉污染对于植物的影响巨大。当植物富集了过多的镉离子，会导致植物的生长受到抑制，更严重的会导致植物的死亡。镉离子在植物体内富集，通过改变叶绿素a和叶绿素b的比值、降低二氧化碳同化能力、改变色素蛋白复合体结构、离子拮抗使必需元素吸收减少等途径，来降低植物的光合作用和呼吸作用［2］，进而影响植物的能量转化和物质代谢。
由于研究植物镉胁迫具有较大的实践意义，已有较多研究课题对植物吸收镉离子的途径进行了探索。有研究表明［3］，植物可能依靠植物皮层组织吸收镉离子，并通过质外体和共质体途径进行镉离子的运输。最终地下部吸收的镉离子通过木质部运输到植物体的地上部。由于镉离子首先富集在植物根部，所以植物根部首先出现问题，如镉离子会攻击细胞核仁、影响mRNA 合成、降低酶活性、破坏膜内外质子平衡等。同时镉离子还会与其他离子竞争，影响蛋白质的合成、破坏蛋白质的高级结构，最终导致蛋白质失活，进而影响细胞的正常代谢。
镉离子经木质部运输到地上部后，影响叶片的光合作用。植物受到镉离子胁迫后会产生如叶片绿色褪去并发生卷曲、叶片边缘发褐、叶柄和叶脉发红、地下部的根系发育减缓等典型症状[4]，对于叶片的损害十分严重。茶树是以叶片作为主要经济器官的作物，所以镉离子对于茶树的影响巨大。
茶树根部在吸收镉离子的过程中，也与其它重金属离子存在相互作用。在铅镉共存的情况下，镉离子的存在会抑制茶树根部对于铅离子的吸收，但铅离子的存在却会使得茶树对于镉离子的吸收增多[5]。所以研究茶树的镉离子胁迫机制，对其它重金属的胁迫也有较大的现实意义。在各种重金属离子中，茶树对于镉离子的吸收量较高，且镉离子对于茶树幼苗的影响较大，从茶树生长发育初期就需要注意镉离子的影响[6]。目前已有研究表明，在茶树体外，根系分泌的有机酸可以与镉离子进行络合。同时在茶树体内，镉离子会大部分与果胶酸盐、蛋白质进行结合[7]。茶树体内的类黄酮化合物种类丰富，已有研究表明[8]，类黄酮类化合物与植物的铝毒害耐受存在关联，且类黄酮化合物合成过程中的转录因子、合成酶类均参与了重金属胁迫的响应。
随着分子生物技术的不断革新和分子育种的不断发展，在分子层面对植物重金属胁迫机制进行研究，以及利用分子生物技术进行耐重金属品种选育都成为了新趋势。目前，菜心[9]、马铃薯[10]、西瓜[11]等作物都已经进行了镉胁迫下的作物转录组测序和分析。在茶树的研究上，前人也已经通过RNASeq、cDNAAFLP、基因芯片等技术，鉴定分离出茶树体内有关干旱胁迫、盐碱胁迫、抗病抗虫等方面的基因，发现了大量可能与茶树抗重金属相关的基因[12]。
在有关茶树重金属胁迫的研究中，发现在铅胁迫下，水培茶树新梢的转录水平发生了变化。存在差异表达的基因片段与已发现的控制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族基因同源性很高，可以初步推测氨基酸代谢与铅胁迫存在相关性[13]。同时，在有关铝胁迫的研究中，从茶树幼苗中分离出了差异表达的细胞色素P450、转录因子等基因[14]。
儿茶素是茶树多酚类化合物的主要组成部分，对于儿茶素合成相关基因也分离研究得较为全面。目前很多儿茶素合成途径中的关键酶基因已经克隆成功，如黄酮类化合物合成的关键酶——查耳酮合酶（GHS）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、花青素合酶（ANS）等[15]。其中反肉桂酸4羟化酶（C4H）、3’类黄酮羟化酶（F3’H）、3’,5’类黄酮羟化酶（F3’5’H）等均属于植物细胞色素P450家族，在儿茶素合成途径中占有重要位置，且在重金属胁迫下存在差异表达。
目前对于儿茶素合成路径已经有了比较全面的认识，C4H作为苯丙烷代谢途径第二步的关键酶，负责催化反式肉桂酸C4位上的羟基化反应，生成p香豆酸，再经过一系列的酶促反应生成儿茶素合成所需的原料——4香豆酰基辅酶A,也可转化为糖苷或糖脂参与儿茶素合成的下游途径[16]。之后4香豆酰基辅酶A与丙二酰辅酶A生成查尔酮，之后的合成路径如图1所示[17]。
本实验选取儿茶素合成过程中的6个关键酶的合成基因作为研究对象，结合不同种类儿茶素的合成路径，以二氢黄烷醇的两条合成路径作为节点，一条途径为通过F3’ H、ANS、DFR合成表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）；另一条途径为通过F3’5’H、DFR、ANS合成表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）。
通过对儿茶素合成相关基因在镉胁迫下的表达进行研究，可以进一步明确镉离子在茶树体内的作用机理，探究镉胁迫对于儿茶素代谢的具体影响机制，同时还可以为茶树抗镉品种的研究提供基础。


图1 儿茶素合成路径
1 材料与方法
1．1 实验材料
进行实验的茶树品种为 ‘白叶1号’，购于江苏省南京市雅润茶业有限公司，为1年生穴盘苗。

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