核受体是调控胚胎发育、胚后发育和生殖的主要因子，影响众多的生理途径，对昆虫的发育有着重要的作用。马铃薯甲虫 Leptinotarsa decemlineata (Say) 是重要的国际检疫害虫，已从马铃薯甲虫中鉴定出21个核受体基因，本文采用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术验证9个马铃薯甲虫核受体基因（ LdE78、LdERR、LdEagle、LdHR39、LdHNF4、LdHR51、LdHR78、LdHR96、LdKnirf ）的序列及测定它们的表达模式。结果表明9个核受体基因的序列均与转录组数据一致。它们在马铃薯甲虫的各个组织和发育阶段中都有不同程度的表达量，且它们均具有特定的时空表达模式，推测这些基因在马铃薯甲虫的生长发育过程中发挥特有的生理学作用。本研究结果为探讨马铃薯甲虫核受体基因的生理功能和分子机制的奠定了基础。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1．1 主要试剂 4
1．2 主要仪器设备 4
1．3 方法 5
1.3.1 总RNA的提取 5
1.3.2 cDNA第一链的合成 6
1.3.3 PCR引物设计 6
1.3.4 PCR反应体系及条件 7
1.3.5 PCR产物的回收纯化 7
1.3.6 连接和转化实验 7
1.3.7 单克隆挑取和菌株扩大培养 8
1.3.8 菌液PCR验证连接转化结果 8
1．4 实时荧光定量PCR反应 8
1.4.1 qRTPCR引物设计 8
1.4.2 qRTPCR反应体系及条件 9
1.4.3 标准曲线的制作 9
1.4.4 模板材料来源 9
1.4.5 基因相对表达量分析 9
2 结果与分析 10
2．1 9个核受体基因序列的RTPCR验证 10
2．2 LdE78的时空表达 10
2．3 LdERR的时空表达 10 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 

2．4 LdEagle的时空表达 11
2．5 LdHR39的时空表达 11
2．6 LdHNF4的时空表达 13
2．7 LdHR51的时空表达 13
2．8 LdHR78的时空表达 14
2．9 LdHR96的时空表达 14
2．10 LdKnirf的时空表达 16
3 讨论 16
致谢 17
参考文献 17
马铃薯甲虫9个核受体基因的分子克隆及时空表达分析
引言
科罗拉多马铃薯甲虫Colorado Potato Beetle（CPB）简称马铃薯甲虫 Leptinotarsa decemlineata (Say)，隶属鞘翅目 Coleoptera 叶甲科 Chrysomelidae，是世界有名的毁灭性害虫，也是我国主要的外检对象[1,2]。寄主主要是马铃薯、茄子、辣椒和其他茄科植物，自其发生以来，在世界各地迅速传播，由于马铃薯甲虫具有较强的繁殖能力和环境适应性，种群数量一直呈上升趋势，危害也逐年增加，马铃薯和其他茄类蔬菜的生产受到了严重影响，造成了很大的经济损失[3]。
长期、大量、不合理的施用化学农药导致马铃薯甲虫抗药性的产生和发展。国内外研究结果表明，马铃薯甲虫兼具代谢抗性、生理学抗性、行为逃避抗性、靶标不敏感抗性等多种抗性机制[4,5]。目前，马铃薯甲虫已对有机氯类、有机磷类和氨基甲酸酯类的多个杀虫剂品种均产生了抗药性[6,7]，而近年来我国新疆地区的一些田间种群对新烟碱类和微生物杀虫剂也出现了低水平抗性[8]。除此之外，由于农业防治和物理防治的局限性，以及生物防治的时效性等问题，现在迫切需要研究马铃薯甲虫的综合防治和新的治理策略[9]。
核受体是古老的转录因子超家族，可以调控靶基因转录[10,11]，它在昆虫的代谢[12]、衰老[13]、性别分化[14]、昼夜节律和次生物质解毒[15]等方面起着关键作用。到目前为止，依据马铃薯甲虫的基因组数据和转录组数据[16,17]，马铃薯甲虫已经被鉴定出有21个核受体基因。结合以往的研究，我们发现鞘翅目、双翅目和膜翅目昆虫的核受体成员的数量相似，说明核受体基因对昆虫的生长和繁殖有非常重要的功能，因而在进化过程中并没有过多的变化，所以鉴定出马铃薯甲虫核受体基因并阐明其生理学功能具有一定的理论意义[1820]。
本文验证了马铃薯甲虫的9个核受体基因， 即Ecdysoneinduced protein 78（E78）、estrogenrelated receptor（ERR）、hormone receptor 39（HR39）、hepatocyte nuclear factor 4（HNF4）、hormone receptor 51（HR51）、hormone receptor 78（HR78）、hormone receptor 96（HR96）、Knirf 和 Eagle的序列。通过实时荧光定量PCR技术筛选合适的定量引物，检测了9个核受体基因在马铃薯甲虫不同组织和发育阶段的时空表达规律[21]。结果表明这些基因可能在马铃薯甲虫的各个组织和发育阶段起到了特有的生理作用。
1 材料与方法
1．1 主要试剂
实验材料
材料来源
TRIzol试剂
美国Invitrogen公司
SuperScript III反转录酶
日本Takara公司
Oligo (dT)18随机引物
日本Takara公司
Taq DNA聚合酶
日本Takara公司
dNTP mixture (2.5 mM和10 mM)
日本Takara公司
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)

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