灰飞虱（Laodelphax striatellus）属半翅目飞虱科，是我国重要的水稻害虫。当前，施用化学农药是主要的防治手段。由于农药的长期大量的不合理使用，导致灰飞虱对多种常规杀虫剂都产生了抗药性。因此，开展抗药性机理研究显得尤为重要。前期已有的研究发现谷胱甘肽-S-转移酶LsGSTd2和LsGSTo2基因在灰飞虱抗溴氰菊酯品系中出现了过量表达，推测其可能与溴氰菊酯抗性有关。本实验在前期已获得了超量表达灰飞虱LsGSTd2和LsGSTo2基因果蝇品系的基础上，通过生物测定的方法来验证LsGSTd2和LsGSTo2与溴氰菊酯抗性的关系。结果显示，与对照组da>9755品系相比，超量表达灰飞虱谷胱甘肽-S-转移酶的da>LsGSTd2和da>LsGSTo2品系果蝇对溴氰菊酯的敏感性没有显著差异，抗性比分别为1.44和1.54。因此，本文研究结果表明灰飞虱LsGSTd2和LsGSTo2基因的过量表达与灰飞虱对溴氰菊酯的抗性无关。
目录
摘要 1
关键词 1
ABSTRACT 1
KEY WORDS 1
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 供试昆虫 3
1．2 供试试剂 3
1．3 饲料制作 3
1．4 杂交配对 3
1．5 生物测定 3
2 结果与分析 3
3 讨论 4
致谢 6
参考文献： 7
超量表达灰飞虱谷胱甘肽S转移酶基因LsGSTd2和LsGSTo2果蝇品系对溴氰菊酯的生物测定
引言
引言:灰飞虱（Laodelphax striatellus）属半翅目飞虱科，是我国重要的水稻害虫之一。灰飞虱以成虫、若虫刺吸水稻、小麦和玉米等多种禾本科作物茎秆的汁液 [1],这是灰飞虱的直接危害；同时，灰飞虱作为重要的植物病毒病虫媒，可传播多种植物病毒病，如水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病等，这是灰飞虱的间接危害，造成的经济损失大，对我国水稻生产有严重的影响 [2]。
目前，防治灰飞虱的措施主要还是喷施化学农药。由于农药的长期大量地不合理使用，灰飞虱对各种药剂出现了严重的抗药性 [3]。 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
例如，1964年日本广岛等地区的灰飞虱种群对六六六及马拉硫磷产生了抗药性；随后，日本多地的灰飞虱种群也相继发现对有机磷和氨基甲酸酯药剂产生了抗性[4]。上世纪90年代，我国发现很多地区的灰飞虱对马拉硫磷、杀螟硫磷和二嗪磷产生了抗药性，而对于经济稍微落后的我国云南等地区的灰飞虱对对拟除虫菊酯类药剂和吡虫啉等仍处于敏感的阶段。到了2006年，马崇勇和高聪芬等采用点滴法监测了江苏无锡和浙江湖州两地的灰飞虱种群对氯化烟碱、有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯等4类9种杀虫剂的敏感性，结果显示：灰飞虱对上述药剂，都产生了不同程度的抗药性，对吡虫啉和甲萘威抗性尤为显著 [5]。
害虫的抗药性机理主要涉及三个方面:害虫表皮穿透速率降低、昆虫对杀虫剂解毒代谢能力增强以及杀虫剂靶标部位敏感性下降[3]。其中，昆虫的靶标抗性是指由于昆虫原先的靶标分子发生了改变，使杀虫剂与靶标的结合能力降低，或者直接丧失了与靶标结合的能力，从而导致了昆虫对农药不敏感，产生抗性。昆虫的代谢抗性是指通过过量表达具有代谢外源有毒物质的多种酶，通过各种催化反应将农药分解为低毒易溶的代谢物并排出体外[3]，达到解毒代谢的目的，从而提高了虫体对药剂的抗性。昆虫解毒代谢酶主要有：细胞色素P450氧化酶、谷胱甘肽S转移酶和酯酶[6]。昆虫的谷胱甘肽S转移酶是昆虫体内重要的二相解毒酶，主要是催化内源的谷胱甘肽与外源的化合物发生共轭作用，形成低毒的共轭物，代谢排出体外来实现解毒目的[7]。谷胱甘肽S转移酶除了可以与外源化合物发生共轭，达到代谢解毒效果外，还可以弥补昆虫对过氧化物代谢缓慢的缺陷，缓解昆虫的氧化应激反应，降低过氧化物对虫体的损伤，从而降低了昆虫的死亡率[8]。并且有研究表明溴氰菊酯可与GSTs的活性中心结合，虫体被动隔离除虫菊酯分子，从而保护生物的分子免受其损伤，提高昆虫抗药性[9]。
溴氰菊酯是迄今开发的生物活性最高的合成拟除虫菊酯杀虫剂，具有杀虫谱广，击倒速度快等特点，对鳞翅目幼虫以及蚜虫的防治效果尤其显著，是现阶段稻田、麦田防治灰飞虱的主要药剂之一[10]。研究发现，在农业生产中连续4年使用高剂量的溴氰菊酯药剂，昆虫就会出现抗药性的问题[11]。高聪芬等的实验表明：南京、湖州和嘉兴等地灰飞虱种群对高效氯氰菊酯的抗性达到了中等水平[12]。研究表明，对于拟除虫菊酯类药剂，除了抗性发展较快的问题之外，施用拟除虫菊酯类药剂还存在交互抗性问题。实验发现，斜纹夜蛾经溴氰菊酯筛选后，发展出了对溴氰菊酯63倍的抗药性，同时该品系对DDT、毒死蜱等多种药剂也产生了较高不同程度的交互抗性[13]，大量使用溴氰菊酯不仅昆虫耐药性增强，同时多种药剂防效也会降低，后期防治农业害虫难度大大增加。这对于农业生产有很大的负面影响。
本实验前期研究发现，在灰飞虱抗溴氰菊酯品系中，灰飞虱谷胱甘肽S转移酶基因LsGSTd2、LsGSTo2的表达量显著上调，分别是敏感品系的1.6倍和2.4倍[14]。推测LsGSTd2和LsGSTo2的过量表达与溴氰菊酯的抗性相关。因此，本文利用果蝇超量表达技术，在获得了超量表达灰飞虱LsGSTd2和LsGSTo2基因的果蝇品系的基础上，通过生物测定的方法验证过量表达的LsGSTd2和LsGSTo2基因与溴氰菊酯抗性的关系。
1 材料与方法
1．1 供试昆虫
本实验所用果蝇为大学昆虫生理生化与分子生物学实验室提供的超量表达灰飞虱LsGSTd2和LsGSTo2基因的果蝇品系与含有目的基因全身表达的强启动子daughterless的daGal4果蝇品系。供试果蝇使用玉米粉、酵母和琼脂、蔗糖做成的人工饲料喂养，放置于光周期为16L:8D，温度25±2℃，相对湿度为60%70%的光照培养箱中扩繁。
实验品系：纯合转基因果蝇品系♂×daGal4♀杂交后代
对照品系：da＞9755（9755♂×daGal4♀杂交后代）
1．2 供试试剂
本实验使用药剂为98%的溴氰菊酯原药，使用丙酮配制成4000ppm的溴氰菊酯母液待用。
用天平称量出20.41mg的溴氰菊酯原药，加入5ml丙酮，配置成4000ppm的溴氰菊酯母液，并梯度稀释至160ppm、80ppm、40ppm、20ppm、10ppm，放入冰箱中保存。实验时药剂现配现用。
1．3 饲料制作
以配制200ml体系为例，用普通电子秤称取玉米粉17g、蔗糖13g、酵母粉45g、琼脂15g和尼泊金甲酯4g，将蔗糖与琼脂放在同一烧杯内。准备200ml无菌水，取适量无菌水倒入玉米粉内搅拌，将剩余水倒入锅中煮沸，停火；取适量沸水加入酵母粉中，搅拌，使其溶解，再将蔗糖与琼脂粉缓慢倒入锅中，边倒边搅拌，煮至透明后，倒入玉米粉，使其混合均匀，开火，加热至黏稠，期间需不停搅拌防治糊底，结成大块。最后倒入溶解的酵母粉混匀，继续加热，将用乙醇溶解的尼泊金甲酯，倒入锅中搅拌均匀，倒出，装瓶。将装好瓶的饲料放置超净台中，一级风吹12h落水，塞好塞子备用。

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