病原菌侵染寄主的过程中会分泌降解酶，如蛋白酶，几丁质酶，脂酶等来加速侵染。相关研究表明，除了蛋白酶外，几丁质酶也会影响病原菌的毒力。例如，过表达球孢白僵菌中的几丁质酶基因Bbchit1便能显著提高菌株毒性。在杀蚊卵菌贵阳腐霉的前期研究中，也鉴定到了6个几丁质酶基因，虫试结果发现，PgGH18-6对贵阳腐霉的毒性表达至关重要。在本研究中，通过生物信息学分析后发现，PgGH18-6含有一个信号肽和一个糖基水解酶GH18（Glycosyl hydrolases family 18）的结构域。利用本实验前期建立起来的C6/36细胞系毒性评估体系，探究PgGH18-6对C6/36细胞是否具有毒性。实验结果表明，PgGH18-6基因对细胞系没有毒性。由此推测，PgGH18-6基因并不能通过杀死细胞来侵染寄主，可能存在其他参与侵染的机制，还需要进一步探索。
目录
摘要 1
关键词 1
abstract 1
Key word 1
引言（或绪论） 1
1、材料与方法 2
1.1供试细胞与菌株 2
1.2试剂及培养基 2
1.3 PgGH186基因的克隆及载体构建 2
1.4无内毒素质粒提取 3
1.5 PgGH186对C6/36细胞的毒性评估 4
1.5.1C6/36细胞系的培养 4
1.5.2C6/36细胞系的转染 4
1.5.3PgGH186对细胞系的毒性检测 5
2、结果分析 5
2.1 PgGH186信号肽预测 5
2.2 细胞表达载体pIB/v5的构建 5
2.3 PgGH186对C6/36细胞系的毒性评价体系 6
2.3.1 细胞转染 6
2.3.2 PgGH186对细胞系的毒性检测 7
3、讨论 8
致谢 8
参考文献 8
贵阳腐霉几丁质酶基因PgGH186对白纹伊蚊细胞系的毒性研究
引言
贵阳腐霉菌（Pythium guiyangense）是我国贵阳医学院苏晓庆教授于1994年在白纹伊蚊的尸体上分离 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
得到的一株灭蚊卵菌，经形态学鉴定和ITS序列分析发现它是一个新种，分类地位为鞭毛菌亚门、卵菌纲、霜霉目、腐霉科、腐霉属[1]。贵阳腐霉菌可以有效地寄生3个蚊虫属的14种，其中包含6种我国重要的媒介蚊虫：白纹伊蚊、埃及伊蚊、致倦库蚊、淡色库蚊、三代喙库蚊和中华按蚊[2]。具有灭蚊能力强、繁殖速度快、易于人工培养以及对非靶标生物安全等优点，对于蚊虫防治具有很好的应用前景[3]。在贵阳腐霉的前期研究中发现，贵阳腐霉既可以通过体表又可通过肠道两条途径进行侵染。
几丁质（Chitin）又称壳多糖，在自然界中的储藏量仅此于纤维素是自然界中第二大丰富且可再生的多糖[4]。广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中，主要是起支撑和保护的作用，在昆虫生长、发育的各个时期也都需要一定量的几丁质[5]。蚊子表皮和围食膜也含有丰富的几丁质。病原菌在侵染寄主时会分泌一些降解酶，如蛋白酶，几丁质酶，脂酶等[6]。其中几丁质酶在一些研究中发现，它能显著影响病原菌的毒性。几丁质酶会催化水解几丁质生成N乙酰氨基葡糖胺，降解昆虫表皮和围食膜，有助于病原菌的成功侵染。前期有研究表明，几丁质酶与菌株的毒性相关，在球孢白僵菌中过表达几丁质酶基因Bbchit1，处理蚜虫[7]后发现，和球孢白僵菌野生型相比，球孢白僵菌对蚜虫的致死浓度降低50%，致死时间降低50%。另外，几丁质酶产酶水平高低与其对害虫的毒力有一定的相关性，可以用于筛选毒性菌株[8]。除此之外，几丁质酶还会影响昆虫蜕皮，生长发育水平。
在植物中，几丁质酶会破坏细胞壁和细胞骨架，进而影响真菌的生长发育，削弱其致病性，从而达到抗菌的效果[9]。寄主植物受到病原菌侵染后会诱导分泌几丁质酶，几丁质酶对真菌孢子的萌发具有抑制作用，进而可以增强植物的抗病性[10]。不仅如此，植物种子萌发可导致几丁质酶释放到周围介质，并抑制真菌的生长繁殖[11]。由此可推测，几丁质酶在抗虫抗病方面有非常重要的作用。
前期研究中，在贵阳腐霉里鉴定到了6个几丁质酶基因，由于都含有糖基水解酶GH18（Glycosyl hydrolases family 18）的结构域，由此命名为PgGH181至PgGH186。其中沉默PgGH186后，贵阳腐霉对淡色库蚊的毒性几乎丧失。本研究为了进一步研究PgGH186，利用本实验室已有的白纹伊蚊C6/36细胞系评价体系，检测PgGH186对C6/36细胞系是否有毒性。
1、材料与方法
1.1供试细胞与菌株
1.2试剂及培养基
1）C6/36细胞培养基：10% Schneiders Drosophila Medium（90%Schneiders Drosophila Medium（Gibco货号：21720024）+10%Fetal Bovine Serum（FBS）（Gibco货号10099133）），需要避光并且在4 ℃冰箱里低温保存；
2）转染试剂：FuGENE® HD Transfection Reagent（Promega货号E2311）；
3）细胞毒性检测试剂：Cell Counting Kit8（CCK8）（东仁化学科技（上海）有限公司，货号CK04）；
4）细胞消化酶：胰蛋白酶液（Trypsin）（Gibco）
5）细胞缓冲液：phosphate buffer saline（PBS）（索莱宝）；
1.3 PgGH186家族基因的克隆及载体构建
1）片段扩增
以贵阳腐霉菌基因组DNA或cDNA为模板，使用诺唯赞超保真酶Phanta SuperFidelity DNA Polymerase进行基因扩增。
片段扩增的PCR反应体系如下：

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/564135.html