: 4关键词 4Abstract 4Keywords: 4引言 51 材料与方法 51.1 供试材料 51.1.1 供试杂草 51.1.2 主要试剂 51.1.3 主要仪器 61.2 试验方法 61.2.1 植株培养及样品收集 61.2.2 西来稗Aux/IAA基因—EcIAAs的筛选 61.2.3 EcIAAs表达量的分析 71.2.4 西来稗的EcIAA16序列的研究 92 结果与分析 142.1 西来稗EcIAAs基因的筛选 142.2 抗性及敏感西来稗EcIAAs的表达量检测 142.2.1 EcIAAs qPCR引物的特异性及其扩增效率 142.2.2 EcIAAs在抗性及敏感西来稗中的表达量 162.3 抗药性及敏感西来稗EcIAA16基因克隆 172.4 抗药性及敏感西来稗EcIAA16序列分析 183 讨论与结论 194 致谢 195 参考文献 20附表 21西来稗AUX/IAA家族基因克隆及表达研究 :西来稗（Echinochloa crus-galli var. zelayensis）是水稻田中的一种恶性杂草，在水稻田中危害极其严重。利用化学药剂治理稻田西来稗是重要的防治措施。二氯喹啉酸是一种植物生长素类除草剂，由于其高效、低毒、高选择性的优点，成为稻田应用最为广泛的除稗剂之一。二氯喹啉酸在我国已有近三十年的使用历史，随着使用年限的增加，稻田西来稗对二氯喹啉酸产生了抗药性。本研究以抗二氯喹啉酸及敏感性西来稗生物型为研究对象，通过荧光定量PCR、RACE等技术手段，研究西来稗对二氯喹啉酸的抗药性与Aux/IAA基因表达量以及Aux/IAA基因的全长序列在抗性及敏感生物型间差异的关系。本研究旨在明确Aux/IAA基因是否在抗性和敏感生物型中存在差异表达和结构差异，为进一步研究该家族基因与抗性的关系打下基础。
目录
引言
引言
稗草，原产于欧洲和亚洲的印度，为一年生或多年生禾本科草本植物，大多为田间杂草，是18种世界恶性杂草之一，对我国农作物的危害位居农田15种严重危害杂草之首。西来稗隶属于稗属杂草，是稗的一个变种，产于华北、华东、西北、华南及西南各省区；多生于水边或稻田中，在长江中下游地区发生严重。
二氯喹啉酸是植物生长素类除草剂，其主要防治对象是 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
稗草，能杀死17叶期的稗草，对47叶期的稗草防效尤为突出。二氯哇琳酸在世界范围内已广泛应用多年，其抗药性问题已在多地出现。自1996年加拿大发现抗二氯喹啉酸猪殃殃生物型以来，已在美国、巴西、中国、马来西亚、巴西、哥伦比亚发现抗二氯喹啉酸稗生物型；此外，一些稻区旱稗、水稗、水田稗以及马唐也对二氯喹啉酸产生了抗药性。徐江艳等研究发现长江中下游地区西来稗对二氯喹啉酸的抗药性问题日趋严重。[1]李永峰等研究发现采自江苏省淮安市的西来稗种群对二氯喹啉酸的敏感性也开始降低。[2]
AUX/IAA 家族基因是生长素应答基因的典型代表，在整个植物生长素信号转导过程中具有重要作用。其编码的蛋白质通过调节生长素信号通路下游基因达到调节植物生长发育的目的。由AUX/IAA 基因编码的蛋白质在植物生长发育中至关重要。AUX/IAA 蛋白负向调节生长素应答因子ARFs(auxin response transcription factors)的丰度，随后表达生长素应答基因。[3]现已明确抗二氯喹啉酸稗草抗性的产生是由于ACC合成酶活性没有被提高，最终乙烯和氰化物没有过量积累而引起的。[4研究发现单一的显性KsIAA16R抗性等位基因是地肤子抗麦草畏的因果基础。所以可以确定IAA16与生长激素类除草剂的抗性有关。[5]
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试杂草
抗二氯喹啉酸西来稗生物型：JCWJR1、SSXBR2；
敏感生物型：JNNXS
注：于2009年和2010年9、10月在江苏省南京市江苏农科院休闲田、江苏省常州市武进区稻田和上海市松江区稻田采集成熟的西来稗种子。根据本研究室徐江艳对以上三个西来稗生物型对二氯喹啉酸的敏感性测定结果和采集地点，分别将其标记为敏感生物型JNNXS(GR50值36.75 g a.i. ha−1)、中抗生物型JCWJR1(GR50值355.85 g a.i.ha−1)和高抗生物型SSXBR2(GR50值2457.79 g a.i.ha−1)。[1]本研究所用种子是于2017年5月对三个西来稗生物型进行繁种后收集的种子。
1.1.2 主要试剂
SMARTer ® RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) 宝生物（TAKARA）工程（大连）有限公司；
pMD19T vector，宝生物（TAKARA）工程（大连）有限公司；
2×PCR Mix，2×Long PCR Mix，东盛生物科技有限公司；
引物，上海生工生物工程技术服务有限公司合成；
RNAsimple总RNA提取试剂盒，天根（TIANGEN）生化科技有限公司；
E.coli Competent Cells，宝生物（TAKARA）工程（大连）有限公司；
PrimeScript™ RT Reagent Kit with gDNA Eraser (TAKARA) 宝生物（TAKARA）工程（大连）有限公司；
SYBR Premix Ex Taq，宝生物（TAKARA）工程（大连）有限公司；
MiniBEST Agrose Gel DNA Extraction Kit，宝生物（TAKARA）工程（大连）有限公司；
1.1.3 主要仪器
UV2550紫外分光光度计，日本岛津制作所；
Fresco 21冷冻台式离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司；
DYY2C型电泳仪，北京六一仪器厂；
E1IX10超纯水器，美国millipore公司；
7500实时荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司（Applied Biosystems）；
GXZ380B型光照培养箱，宁波江南仪器厂；
SIMF124制冰机，日本 SANYO 公司；
ZHWY200B型恒温振荡器，上海智诚分析仪器制造有限公司；
LABSTAR 2×Thermocycler（PCR仪），莱比信中国；
D170型自动控制压力蒸汽灭菌锅，北京发恩科贸有限公司；
电热恒温鼓风干燥箱，宁波江南仪器厂；
凝胶成像仪，美国UVP公司；
超低温冰箱，中国海尔；
微量移液器（1000100 μL, 200100 μL, 2010 μL, 2.50.2 μL），德国 Eppendorf公司;
SPX智能生化培养箱，宁波江南仪器厂；
DKS24型电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 植株培养及样品收集
1.2.1.1 植株培养
本研究采用水培法培养植物材料。首先对三个西来稗生物型种子进行催芽，将种子均匀撒在铺有两层医用纱布的塑料盘中，种子上面再盖一层医用纱布，将其置于植物生长箱中（30°C /25°C,）12 h光照(300 μmol m−2 s−1) ，12h黑暗，每天浇一次水。待种子萌发后，将其转移至含有300 mL春日井营养液的一次性纸杯中，置于与催芽相同的环境中培养，营养液每三天换一次。

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