稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是水稻生产上一种毁灭性真菌病害，由于稻瘟病菌致病性的变异，许多水稻新品种失去抗性，因此对稻瘟病菌开展研究显得十分重要。其中，细胞壁作为细胞的一个重要屏障，细胞壁的完整性对于细胞维持形态以及抵抗外界环境压力具有重要意义。现有研究表明，在酿酒酵母中，参与细胞壁调控的MAPK激酶信号途径中，KNR4调控几丁质合成基因的转录，并可以抑制CWH（Calcofluor white hypersensitive）突变体的表现型。所以本文针对稻瘟病菌中的MoCWH基因进行敲除，采用同源重组的方法构建敲除载体及回补载体，从而获得ΔMocwh突变体并对其回补菌株的生长表型、致病性以及在细胞壁胁迫剂环境下细胞壁完整性情况进行分析。结果表明，稻瘟病菌MoCWH基因缺失后，菌丝生长速度减弱，产孢量减少，菌丝量减少，致病力下降，同时细胞壁完整性出现缺陷。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 供试菌株 3
1.2 供试菌株的培养条件 3
1.3 MoCWH敲除突变体的获得 3
1.3.1 敲除载体的构建 3
1.3.2 敲除载体的筛选 3
1.3.3 Southern blot 验证 3
1.3.4 敲除载体互补菌株的获得 3
1.4 MoCWH敲除突变体的营养生长测定 4
1.5 MoCWH敲除突变体的产孢测定 4
1.5.1 敲除突变体产孢量的统计 4
1.5.2 敲除突变体的孢子侧拍 4
1.6 MoCWH敲除突变体的致病力分析 4
1.6.1 水稻喷雾 4
1.6.2 离体大麦点滴 4
1.7 MoCWH敲除突变体细胞壁完整性分析 4
2 结果与分析 4
2.1 MoCWH的敲除和互补转化子的获得 5
2.1.1 敲除载体的构建 5
2.1.2 敲除载体的筛选及验证  *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
5
2.1.3 互补菌株的获得 6
2.2 MoCWH敲除突变体的表型测定 6
2.2.1 突变体的营养生长测定 6
2.2.2 突变体的产孢量测定 7
2.3 MoCWH敲除突变体的致病力分析 7
2.3.1 水稻喷雾致病性分析测定 7
2.3.2 离体大麦点滴致病性测定 7
2.4 MoCWH敲除突变体细胞壁胁迫及敏感性分析 8
3 讨论 9
致谢 9
参考文献 9
稻瘟病菌MoCWH基因的功能分析
引言
引言
稻瘟病菌引发的稻瘟病是水稻上的最重要病害之一，在全世界稻区均有发生，严重威胁世界的粮食安全。目前，对于该病害的控制，主要以选育抗病品种为主，因地制宜选取适合的品种，同时以化学防治为辅，但由于该病原菌致病生理小种变化过快，导致某些杂交水稻品种抗稻瘟病特性下降，病菌抗药性上升。这些抗药性群体的产生也伴以新的致病品种的出现，最终导致选育的抗病品种和研发的新农药失去实际价值。因此，稻瘟病的防治始终是水稻生产上的一个重要难题，而控制该病害的重要前提是了解该病原菌的生长发育及致病分子调控机制。
稻瘟病菌侵染水稻主要依靠分生孢子，分生孢子落到水稻叶片表面之后，在适宜的温度湿度环境下，就会在与水稻的接触表面释放出粘性物质（STM spore tip mucilage），使分生孢子可以粘附着叶片而不会掉落[12]些粘性物质主要包括蛋白质，糖类和脂肪。大约2小时后，孢子开始萌发形成芽管，芽管通常从孢子的一个顶端细胞生长并伸长，而且芽管顶端会分泌一种粘性物质，使得芽管能够紧贴着水稻叶片表面，可以在生长中防止被雨水冲走。4小时后，芽管停止生长，顶端开始弯曲并逐步膨大形成附着胞[2]。随着时间的推移，在附着胞细胞壁中出现了黑色素的沉积，并且最终形成黑色素层。这些黑色素层允许水分子自由通过，但溶于水的甘油等物质不能通过，而附着胞在此过程中建立并且维持的膨压很大，经过试验计算，压力可以达到8.0 MPa [3]。附着胞完全成熟后，内部积聚了巨大的膨压，通过挤压产生侵入钉，侵入钉可以穿透水稻表皮，侵入到植物细胞内部，和细胞膜形成一个空腔结构[4]。
侵入钉侵入植物细胞后，和水稻持续一段共生状态，随后分化成侵染菌丝，并迅速扩展到整个细胞以及临近细胞，接着叶片出现病斑。接种72小时后，病原菌的生物量可以达到已发病叶片的10%[5]。随着时间的推移，这些病斑开始蔓延，逐步形成“三部一线”的典型病斑，这些病斑在合适的条件下，会重新产生分生孢子梗，接着分化产生大量的分生孢子，这些分生孢子从病斑中被释放出来，然后被潮湿的空气带到附近的水稻植株上，从而开始新一轮的侵染[6]。后期稻瘟病菌以菌丝体和分生孢子的形式在病稻草或谷粒上越冬，成为下一年的侵染源[7]。
真菌中的信号传导通路影响和改变着细胞的生长、分化、以及致病性[8]，在稻瘟病菌信号途径中的主要调控因子（MoMagB、MoMac1、MoRgs1等）都依赖于cAMP（cyclic adenosine monophosphate） [912]。cAMP作为常见的第二信使，可以激活激酶、转录因子等下游引物[8] 。之前研究表明，cAMP在稻瘟病菌中起着至关重要的作用，影响着病菌的生长、产孢、表型以及致病性情况[9] [1316]。同时，高亲和力磷酸二酯酶MoPdeH通过调节细胞内cAMP水平，构成cAMP信号的另一个主要调控因子，而MoPdeH 也能影响病菌的生长发育和致病性[1617]。同时MoPdeH也能影响细胞壁完整性，表现为ΔMopdeH突变体的菌丝自溶和致病性下降[16]。
而在酿酒酵母中，与细胞壁完整性（CWI）相关的MAPK信号途径是细胞对于胞内信号和外界环境条件刺激应答的重要调控手段之一[1820]。CWI信号通路的激活依靠5个表面信号感知蛋白Wsc1，Wsc2，Wsc3，Mid2和Mtl1。在细胞接受外界的细胞壁压力刺激时，这些感受器与鸟苷酸交换因子Rom2相互作用，Rom2进而激活Rho家族的GTP酶Rho1并且使其释放重新回到细胞膜上。Rho1激活蛋白激酶C（Pkc1），后者磷酸化保守的MAP激酶串联体最上游的蛋白激酶Bck1（MAPKKK）。Bck1接着将信号传递给蛋白激酶Mkk1/Mkk2（MAPKK），然后再传递给蛋白激酶Mpk1/Slt2（MAPK）。[29]最后Mpk1/Slt2磷酸化转录因子Rlm1和SBF复合体（包括Swi4和Swi6），来进一步调节细胞核中与细胞壁合成、重建以及与细胞周期相关的基因的表达[21]。

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