植物内源 Small RNAs 是一类大小在 18-25nt 的非编码的单链 RNA 分子，主要作用于转录水平或者转录后调控，从而调控基因的表达，在植物免疫过程中起着重要的作用，实验室前期研究发现，在蜡质芽孢杆菌 AR156 调控的系统抗性形成过程中，对多个 miRNAs 存在调控，其中miR472、miR825 以及 miR825*在 AR156 处理后，能够发生显著下调。为探究miR472在蜡质芽孢杆菌AR156诱导植物系统抗病性过程中的作用，本研究以蜡质芽孢杆菌AR156-丁香假单胞菌DC3000-拟南芥互作模式为研究对象，对前期预测的miR472的五个靶标基因进行了克隆及验证，为后续对miR472的进一步研究提供理论基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法 4
1.1供试材料 4
1.1.1 供试植物4
1.1.2 供试菌株4
1.2供试试剂4
1.2.1培养基4
1.2.2试剂盒4
1.3 试验方法4
1.3.1 植物材料培养与菌株培养4
1.3.2克隆靶标基因4
1.3.2.1 提取基因组DNA4
1.3.2.2 目的基因的扩增4
1.3.2.3 PCR 产物的回收与纯化4
1.3.3构建表达载体5
1.3.3.1过渡载体构建5
1.3.3.2 最终表达载体构建 6
1.3.3.3转化、筛选与鉴定7
1.3.4 烟草瞬时表达7
1.3.5烟草蛋白提取及靶标基因蛋白水平检测8
1.3.5.1跑蛋白胶SDSPAGE8
1.3.5.2Western Blot具体步骤：8
1.3.6 Pst DC3000 定殖测定8
1.3.7数据分析8
2 结果与分析8
2.1 载体构建8
2.2烟草瞬时表达10
2.3烟草蛋白提取及靶标基因蛋白水平检测10
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2.4拟南芥突变体接种病原菌DC3000的致病性检测11
3讨论12
致谢12
参考文献
拟南芥中miR472靶标基因的克隆及验证
引言
引言
为抵御病原菌的侵染，植物体已经进化出一套复杂的免疫机制[1，2]，其中第一种类型的抗病机制是病原菌相关分子模式 PAMPs，比如鞭毛蛋白、脂多糖类、糖蛋白、甲壳素等，能够被植物体细胞膜上的模式识别受体（PRRs）识别，从而激活下游的防卫反应——包括 MAPK 蛋白激活、活性氧迸发、胼胝质的沉积、防卫相关基因的表达等等。这种防卫机制被称为 PAMPs 激活免疫（PTI）[36]。另一种机制则是利用植物体内产生的一些抗性蛋白，能够识别病原菌特殊的效应因子，从而诱导受体激活的免疫（ETI）。
侵染位点激活的 PTI 或者 ETI 能够诱导植物产生广谱抗性，抵抗病原菌的侵染[7]，这也就是所谓的获得性系统抗性（SAR）。SAR 往往伴随着水杨酸水平的提高与防卫相关基因的表达水平上调，并产生长距离的信号转导，诱导植物非侵染部位对病原的抗性[8]。植物系统抗性也能够被一些有益微生物所诱导，也就是所谓的诱导系统抗性（ISR）。一般情况下，ISR 一般不依赖水杨酸信号通路，没有 PR 蛋白的积累。比如一些荧光假单胞菌，在水杨酸不积累突变体拟南芥 NahG 上，仍能诱导植物产生系统抗性。另外也有一些 ISR 主要通过水杨酸信号通路，如 Kachroo and Robin 报道，铜绿假单胞菌 7NSK2 能够诱导大豆以及番茄产生系统抗性，但是在水杨酸不积累转基因植株 NahG 番茄中，诱导抗性的能力就消失了[910]。此外，据前期研究表明，蜡质芽孢杆菌 AR156 能够诱导拟南芥产生系统抗性；蜡质芽孢杆菌 AR156 处理能够激活防卫相关基因 PR1、PR2、PR5 以及 PDF1.2 的表达。以上结果表明蜡质芽孢杆菌 AR156 能够同时激活水杨酸以及乙烯茉莉酸两条信号通路[11]。
植物内源 Small RNAs 是一类大小在 1825nt 的非编码的单链 RNA 分子，主要作用于转录水平或者转录后调控，从而影响基因的表达。就目前报道发现，大多数 Small RNAs 是由 RNaseIII 核糖核酸酶 DCL 蛋白作用下产生的，并与 AGO 蛋白形成沉默复合物，进而发挥其功能。植物内源的 Small RNAs 介导的基因沉默主要是通过 mRNA 的切割/降解进行转录后水平的调控，或者通过 DNA 的甲基化或者染色体的修饰等手段进行转录水平的调控[1213]。Small RNAs 根据它们的前体结构和合成途径，目前可以分成两大类：microRNAs 和 siRNAs。microRNAs 是由具有发卡结构的前体经过 DCL 剪切加工而成。而 siRNAs 主要是由长的双链 RNAs 剪切加工而成，通常需要 RNA依赖的 RNA 聚合酶（RDRPs or RDRs）和植物特有的核糖核酸RNA聚合酶（Pol）IV 或 V[14]。
Small RNAs 的作用方式主要是形成 RISCs 复合物，以此抑制 mRNA 的翻译、 调控mRNA 的降解、调节 DNA 或组蛋白甲基化（导致转录沉默）。研究发现，通常一些 siRNAs 或 miRNAs 以碱基互补配对原则与靶 mRNA 结合，随后 RISCs 复合物对结合的 mRNA 进行剪切。另一些 siRNAs 和 miRNAs 不能剪切靶标 mRNA，而是通过调用其他的一些蛋白与 RISCs 复合物一起作用来抑制 DNA 转录或靶标 mRNA的翻译[15]。研究还发现，small RNA 与靶标的结合具有特异性，miRNAs 的末端高度保守，通常结合 mRNA 的3′UTR区域，且特异性较高，但是 miRNAs 与靶标的结合无需遵循完全碱基互补配对原则，miRNAs 识别 mRNA 的关键位点是5个左右核苷酸，通常该关键位点之外的碱基完全配对时启动 miRNA 对 mRNA 的降解，无需百分之百完全配对。siRNAs 的末端变异较多，结合位点可以是 mRNA 的任何部位，但是 siRNAs 与靶标的结合需百分之百完全配对。在植物中 Small RNAs 的传递主要依赖维管束，Small RNAs 在细胞间传递并触发非细胞自主性基因沉默。Chitwood 等研究发现，miRNAs 的移动对于植物生理信号的传递起到非常重要的作用，siRNAs 的移动对于抗病毒反应及稳定转座子也有很重要的影响。植物中的siRNAs 通常是从茎运输到根，有些 Small RNAs 运输到分生组织中，有些运输到花粉或发育的种子中，这些移动的 Small RNAs 对子代的表型也有相关影响。另外有研究表明，Small RNAs 在植物体内长距离运输依赖 RDR6、SGS3 等的参与[16]；短距离运输依赖DCL4的参与[17]。

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