病原卵菌辣椒疫霉（Phytophthora capsici）寄主非常广泛，每年对我国农业生产造成严重损失。研究寄主与辣椒疫霉的互作机制，可为防控疫霉病害提供理论支持和技术指导。辣椒疫霉效应子PcRxLR207可直接作用于拟南芥中一组与植物免疫系统的重要调控因子ACD11（Accelerated cell death11）互作的蛋白BPA1（binding partner of ACD11）和BPLs（BPA1 Like proteins），研究表明这类蛋白在植物与辣椒疫霉互作过程中发挥着重要作用。BPLs基因家族的成员有6个，并且存在着功能冗余，阻碍了对其具体功能的进一步研究，因此本实验拟通过杂交的方式获得BPLs基因的多突变体，为后续实验提供材料。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1材料要求 4
1.1.1拟南芥材料 4
1.1.2验证材料4
1.2拟南芥种植5
1.2.1拟南芥种子消毒与春化5
1.2.2土壤配比和点种5
1.2.3幼苗处理6
1.2.4幼苗生长条件控制6
1.3拟南芥杂交6
1.3.1选择母本和父本6
1.3.2去雄6
1.3.3人工授粉6
1.4杂交验证6
1．4.1CTAB法提取基因DNA6
1.4.2PCR杂交验证6
2结果与分析7
2.1拟南芥bpl基因突变型家族的获得结果7
2.1.1拟南芥的种植 7
2.1.2拟南芥野生型和基因型的杂交8 2.2拟南芥bpl植株验证结果9
3讨论10
致谢11
参考文献12
实验材料及试剂4
表1. PCR过程中用到的上下游引物5
拟南芥BPLs基因家族多突变植株的获得
引言
引言：辣椒疫霉（Phytophthora capsici）隶属于卵菌纲（oomycetes *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
）。可侵染葫芦、辣椒和茄子等多种蔬菜，造成疫病。该病流行速度很快，常致植物大片死亡，损失严重[1]。选育抗辣椒疫霉的品种是目前控制该病的有效措施，但是因为辣椒疫霉病害流行速度快，也容易产生变异，致使作物易丧失抗性，防治效果有限。辣椒疫霉在侵染过程中会产生效应蛋白，利用相应的效应蛋白调控植物的免疫来促进自身侵染[2][3]。先前的研究筛选到一个可以在烟草上引起细胞死亡的效应因子PcRxLR207，并利用酵母双杂交系统发现此效应因子可与一组与植物免疫系统的重要调控因子ACD11（Accelerated cell death11）互作的蛋白BPA1（binding partner of ACD11）和BPLs（BPA1 Like proteins）[4]。在之前的研究中发现PcRxLR207可以激活活性氧介导的烟草细胞死亡对辣椒的毒力[5]。然后我们证明这个效应子针对BPA1和6个BPLs成员在拟南芥中的相应的突变体是否导致活性氧增强[4][6]。此外，先前研究表明，BPA1和BPLs在植物免疫中具有功能冗余，BPA1和BPL1、BPL2、BPL3、BPL4以功能冗余的方式对疫霉病菌的抗病性进行负性调节[4]。通过BPL1和BPLs的突变增强了植物免疫细胞的抗药性。研究结果发现在Y2H系统中ACD 11与BPA 1和BPL 2/3/6在内的7个成员是相互作用的。采用辣椒疫霉游动孢子悬浮液对col0分离出的叶片或相应的突变体进行接种。在感染36小时的紫外光下拍摄疾病症状，接种结果显示，与Col0相比，病原体的抑制定植出现在bp13上，病变区域减少29 ％。在生物胁迫和非生物胁迫下，RxLR207转基因植株、BPL1和几个BPL突变体均表现出活性氧积累和细胞死亡的增强，以及RBOHD的上调表达和CAT2的抑制表达[6][8]。这表明BPA 1和BPLS作为新的调节因子参与了ROS稳态调节[8]。BPA 1、BPLS和RxLR 207在植物中与ACD 11相互作用且BPA1和BPLs是ROS介导的防御反应和抵抗的负调节因子[4][6]。在测试这些沉默植物对辣椒疫霉的抗性实验中ACD11沉默的Col0上出现了对病原体的抑制定植，表明其在防御反应中的负面作用。此外，在bpl4背景条件下中沉默BPA1中观察到其对辣椒疫霉菌感染的抗性增强[4]。在bpl2背景中单独沉默BPL1、BPL4一个或BPL1和BPL4一起沉默的发现相同的表型，揭示了BPA1和bpl14也是负调节因子并且在植物免疫中具有功能冗余的事实[4]。为了阐明BPLs调控植物免疫的机制，研究对接种前后的拟南芥6个BPL基因的TDNA插入突变体和过表达RxLR207的拟南芥进行了RNAseq，并对数据进行了分析。发现BPL1、BPL3、BPL4基因的主要功能是调节次生代谢和活性氧循环，功能相近[4][9]。在响应RxLR207的通路中，BPL1、BPL3的功能有很大的功能冗余，本实验拟通过杂交的方式，获得BPL基因的多突变体，为今后的研究打下基础[4]。
该实验通过在拟南芥植株体上进行所需蛋白基因的培养的研究，为得到具有相对完善的基因数据和蛋白功能的拟南芥植株，故将实验分为三部分进行：1）拟南芥的种植；2）拟南芥杂交和多突变体的培养；3）验证杂交结果。
拟南芥生长周期较短，种植和生长不受季节限制，并且为自花授粉植物，因此拟南芥能在实验室中较快生长且容易杂交。在拟南芥培养过程中，光照时间和强度、温室温度湿度、pH值、营养条件对拟南芥的生长发育过程有非常重要的影响[10]。
材料与方法
1.1 材料要求
1.1.1 拟南芥种植材料
拟南芥可在非无菌条件下，生长在土壤或人工配制的各种培养基中。容器：花盆或多穴塑料盘。种子：拟南芥野生型种子，bpl单突变基因型种子。仪器：灭菌锅，离心机。试剂：无水乙醇，次氯酸钠，无菌蒸馏水，液氮。用品：镊子，手套，竹签，绳子，蛭石，营养土（黑土）。

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