番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus， TSWV）是番茄斑萎病毒科（Tospoviridae），正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）的代表种，属于植物多分体负义链RNA病毒。该病毒寄主范围很广，并通过西花蓟马以持久的方式传播，在全世界范围内造成严重危害。实验室的前期研究发现在本氏烟中瞬时表达MPKKK7基因能够促进TSWV的增值和侵染。为进一步确定MPKKK7蛋白在TSWV侵染过程中的作用，本研究构建了携带YFP荧光蛋白的MPKKK7基因表达载体p1300-YFP-MPKKK7，然后通过农杆菌浸润的方法在本氏烟中瞬时表达YFP-MPKKK7融合蛋白并在荧光显微镜下观察YFP荧光，发现YFP信号定位于细胞质，说明YFP-MPKKK7蛋白已在植物细胞中表达且同时定位于本氏烟细胞的细胞质。本研究拟利用该表达载体制备转MPKKK7基因的本氏烟愈伤组织，为深入解析TSWV的致病分子机制奠定基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）4
1.材料与方法5
1.1构建p1300YFPMAPKKK7表达载体5
1.1.1目标片段的扩增5
1.1.2目标片段和载体的酶切5 1.1.3目标片段和载体的连接6
1.1.4连接产物的转化6
1.1.5 菌落PCR6
1.1.6质粒DNA的提取6
1.2 YFPMAPKKK7的瞬时表达7
1.2.1农杆菌的转化7
1.2.2农杆菌浸润法在本氏烟中瞬时表达YFPMPKKK7蛋白7
1.3实验用植物7
1.4培养基7
1.5通过叶盘法获取目标基因7
2.结果与分析8
2.1 p1300YFPMPKKK7的构建8
2.2在本氏烟表皮细胞中瞬时表达YFPMPKKK7 9
2.3 MPKKK7基因本氏烟愈伤组织的制备9
3.讨论10
致谢11
参考文献11
图1 MPKKK7基因的PCR扩增产物8 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 

图2 菌落PCR的扩增产物9
图3 YFPMPKKK7融合蛋白在本氏烟叶片中的瞬时表达9
图4在出芽培养基上培养810天的本氏烟叶碟9
图5污染的本氏烟叶碟10
MPKKK7基因植物表达载体的构建及转基因本氏烟愈伤组织的制备
引言
引言
番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）是番茄斑萎病毒科（Tospoviridae），正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）的代表种，属于植物多部分负义链RNA病毒。该病毒寄主范围很广被蓟马广泛传播[1]，在全球内造成严重危害，在2011年世界上列出十大最危险病毒中排名第二。1965年，第一次在大丽菊分离鉴定到TSWV，该病毒随后从西红柿，辣椒和其它观赏植物检测[5]。在90年代末，番茄斑在日本迅速蔓延萎病毒，成为在温室栽培蔬菜和观赏植物的最严重的病原体之一[2]。TSWV和一些番茄斑萎病毒引起的严重疾病和经济损失，以蔬菜和园艺植物，如西红柿，辣椒，烟草，花卉和水果在中国云南省[6]。
TSWV第一次分离得到是在1965年，从其寄主植物大丽菊中分离纯化，随后该病毒就扩展到很多观赏植物以及蔬菜植物中，包括辣椒和番茄。在90年代末日本发生番茄斑萎病毒大规模流行，危害温室栽培蔬菜以及观赏植物，造成重大经济损失。在中国危害较大的地区是中国云南，在其大规模流行时，对云南省的蔬菜以及园艺植物均造成严重病害，影响蔬菜产量及观赏价值，造成严重经济损失[6]。SWV侵染植物后会产生明显感病症状，在植物各组织产生斑点，发病严重时会引起系统侵染最后整株植物坏死。TSWV侵染在植物中会表现明显的发病进程，在侵染初期系统叶表现叶片卷曲，随后会产生生长点坏死，最后整株植物枯萎[12]。
TSWV病毒粒体呈近球形，有包膜，病毒粒体中含有病毒的核衣壳蛋白复合体（Ribonucleoprotein, RNPs）[10]。TSWV与布尼亚目其他科病毒的基因组结构有几个共同的特征：病毒粒子近多边形，直径80~120 nm。TSWV病毒粒子内含有3条RNA：LRNA、MRNA和SRNA，其中5′与3′端序列比较保守。LRNA是反义链编码RNA–依赖性型RNA聚合酶（RdRp），约330 kD，它利用寄主植株体内的mRNA启动病毒核酸的转录。MRNA和SRNA是编码两种蛋白质两个感测链。所述MRNA有义链编码非结构蛋白NSM，34kD;互补链编码两个糖蛋白前体，127 kD，最终加工成Gn（75 kD）与Gc（46 kD），分别经过糖基化为78 kD的Gn和58 kD的Gc[11]。3种基因组RNA与N蛋白紧密联系形成核糖体核蛋白（RNPs）。寄主衍生的膜与脂质包封的糖蛋白将RNPs包封其中。
丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPKs）是一类丝氨酸。MAPK信号通路在真核生物中高度保守，其生物学功能主要是把细胞外面的干扰信号转达到细胞核并发生一系列的细胞的生物学反应。植物的MAPK不仅参与调控植物的生长发育过程还发挥着转达病原物侵染，干旱及温度变化等多种生物及非生物性刺激信号的作用[4]。MAPK信号通路通常由3种在功能上相关联的蛋白激酶构成，包括MAPK激酶激酶（MAPK kinase kinase, MAPKKK），MAPK激酶（MAPK kinase, MAPKK）和MAPK。在响应胞外的刺激信号时，MAPKKK首先被激活从而磷酸化并激活MAPKK，然后再由MAPKK磷酸化并激活MAPK。被激活的MAPK接着磷酸化一定条件的下游效应蛋白从而激活相应的细胞反应。
MAPK在不同的生物中功能的调控方式都不相同。单细胞生物如酿母菌MAPK 级联的调控主要是穿过翻译后润饰，而MAPK转录水准改变的征象则很少见，而MAPK转录水准改变的征象则很少见[7]。多细胞真核生物MAPK级联的调控除了通译后润色，还会受到活性持续时间、信号连接蛋白（scaffoldingproteins）、细胞定位、转录、转录后可变剪接、胁迫类型等影响。不一样的MAPK持续不断有活性的可以能够让细胞发生不同的生理活动。烟草NtMEK2调控中，当NtMEK2的活性连续时间很短时，下游作用NtSIPK将引发强烈的抗性基因；当NtMEK2产生的连续时间的活性的很长时，下游作用NtWIPK可以导致引发细胞死亡。

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