水稻稻曲病是由稻曲菌侵染水稻引起的真菌病害，目前已成为世界稻谷主产区主要的真菌病害之一，对水稻的质量和产量产生严重的为害。由于此病害在初期发生较轻，因此长期不被人们重视。目前针对稻曲病菌基因功能的研究主要通过病原菌表达谱分析，或是通过对随机插入突变体库获得突变体对其基因进行功能分析，其通过同源重组获得基因敲除突变体的遗传转化体系尚不成熟和稳定。由于基因敲除突变体的获得是研究基因功能的基础，该体系的不成熟严重限制了稻曲病菌基因功能的研究。本实验通过同源重组原理构建稻曲病菌Uv_3348特异性基因的敲除载体和CRISP/Cas9载体，利用PEG介导的原生质体转化法获得Uv_3348基因的转化子，为快速解析稻曲病菌的基因功能及致病分子机制提供了实验原理和技术支撑。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1引物设计原则 4
1.2.2 Uv_3348基因敲除载体的构建4
1.2.3 CRISPR/Cas9载体的构建5
1.2.4稻曲病菌的原生质体转化5
1.2.5回补载体的构建 5
2结果与分析8
2.1Uv_3348基因敲除载体的构建8
2.2CRISPR/Cas9载体的构建9
2.3Uv_3348回补载体的构建9
3讨论9
致谢9
参考文献10
稻曲病菌Uv_3348基因的功能研究
引言
引言 水稻稻曲病是由稻曲菌侵染水稻引起的真菌病害，现已成为世界稻谷主产区主要的真菌病害之一，对水稻的质量和产量产生重大的为害。从19世纪初期开始，稻曲病在中国，美国和日本也分别被报道，但是仅有零星发生。在20 世纪 80 年间稻曲病在中国农业生产上还是次要病害，随着水稻品种更新加快、施肥程度提高，稻曲病渐趋加重[1]。从最南端海南直至最北端黑龙江，稻曲病不仅会造成水稻产量损失，而且会影响稻米品质。稻曲病发生危害的历史 短、研究起步晚，很多研究结果不尽一致，特别是在稻曲病 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
发生规律和防治应用方面，因此很多内在机理有待揭示。稻曲病菌的致病过程是稻曲病原菌和水稻寄主相互识别并作用的过程。目前针对稻曲病菌所进行的基因功能研究，以及稻曲病菌在侵染过程中与寄主植物的分子互作机制，主要通过病原菌的基因表达谱分析，或是对随机插入突变体库进行性状筛选的方法进行。通过基因敲除得到靶标基因的敲除突变体，是基因功能验证的基础。但是由于该病原菌同源重组的效率极低，很难对靶标基因进行深入研究，极大限制了对于该病原菌基因功能的研究，也限制了该病原菌分子致病机理的研究[2]。稻曲病菌中Uv_3348基因同源基因在近缘菌中序列和功能较为保守，对于病原真菌的生活史较为重要，该基因的缺失会导致一系列表型出现，因此，在稻曲病菌基因敲除体系构建的过程中，选定了该病原菌中的Uv_3348基因做为靶标基因进行敲除。
CRISPR /Cas9 系统是一种后天免疫防御系统，其功能是保卫古细菌或细菌免受外来质粒或噬菌体的侵入。这一类古细菌或细菌基因组的CRISPR序列能表达和入侵者基因组序列相识别的RNA。如果噬菌体等外来物入侵，此防御系统的CRISPR序列会表达这类RNA 并通过互补序列结合识别入侵者的基因组序列，随后CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA，达到抵制入侵的目的。近几年来兴起的基因组定点编辑技术主要包含几种DNA核酸酶：归巢核酸内切酶，锌指核酸酶(ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)[3]，这些核酸酶都是依赖于在特异位点产生DNA双链断裂，引发细胞内DNA修复机制，如同源重组和非同源末端连接，从而导致特异位点的编辑。然而，ZFNs和TALANs技术操作复杂且对DNA甲基化敏感等因素，限制了其应用。CRISPR/Cas系统(CRISPR/Cas system)是于2013年发现的新的基因组编辑技术，它不仅能克服以上缺陷[4]，而且可以同时进行多个基因的编辑，很大程度上提高了基因编辑的效率，因而具有更大的应用潜力。当前CRISPR/Cas9系统已经作为一种高效的基因定点编辑技术普遍应用于植物[5]。
基于CRISPR/Cas9技术建立稻曲病基因敲除载体，构建遗传转化体系的建立并筛选转化子，对稻曲病致病机理进行深入的研究[6]。稻曲病菌遗传转化体系的建立,将为研究稻曲病菌的致病机理和分析遗传变异机制打下重要基础。在稻曲病菌致病机制研究的基础上,依据稻曲病侵染循环各个阶段的特点,有针对性地研究制定各种防治策略,控制稻曲病的为害。
在基因组测序及基因功能分析方面，孙文献对基因组测序结果进行了报道，并且预测了其中可能的效应子基因[7]。张震等克隆了稻曲病菌内PMK1 同源基因UVMK1，并且在稻瘟病菌中进行了异源表达，验证了该基因与PMK1 基因的同源性[8]；饶玉春等也通过测定HOG1 同源基因在渗透压胁迫下表达量的变化，在一定程度上说明了HOG1 同源基因在稻曲病菌中功能的保守性[9]。
本实验拟通过同源重组原理构建稻曲病菌Uv_3348特异性基因的敲除载体和CRISP/Cas9载体，利用PEG介导的原生质体转化法获得这Uv_3348基因的敲除突变体，为深入研究Uv_3348基因在稻曲病菌生长发育、致病性及毒素合成过程中的生物学功能奠定基础，在常用转化体系的基础上，采用CRISPR/Cas9技术，对稻曲病菌的遗传敲除载体进行构建，大大提高了同源重组效率[10]，建立稻曲病的遗传转化体系。本实验的研究结果将帮助我们构建稻曲病菌功能基因Uv_3348的遗传转化体系[11]，为进一步阐明Uv_3348基因的致病机理提供基础，并对其他功能基因的致病机理的研究有重要借鉴意义。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1供试的菌株和培养基
本研究使用稻曲病菌野生型菌株、Uv_3348基因敲除突变体菌株均采用滤纸片法保存于20℃。菌丝体PSA培养基中培养七天，用于稻曲病分生孢子的制备[12]。2%TB3培养基：3g Yeast extract;3g Casamino acids;20g Sucrose;固体培养基加1.3%1.5%琼脂粉，121℃灭菌20min。LB培养基：10g Trypyone;5.0g Yeast Extract;10g NaCl;加1.3%1.5%的琼脂粉，121℃灭菌20min。PSA/PSB培养基：将200g土豆于蒸馏水中煮沸，三层纱布过滤后加入20g蔗糖，固体培养基加1.3%1.5%琼脂粉，121℃灭菌20min。
1.2方法

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