苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis，简称Bt，它们在形成孢子时同时产生具有杀虫活性的Cry毒素。自1996年以来，转Bt基因抗虫作物（表达Cry毒素）在全球大面积商业化种植，取得了显著的经济和生态效益,但是长期使用后害虫所产生的Bt抗性降低了它们的使用效率。棉铃虫抗性品系LF60和敏感品系比较后发现，抗性品系对Cry1Ac毒素拥有1000倍的高水平抗性。在LF60抗性品系中，我们发现了与抗性相关的ABCC2基因突变（缺失6 bp）。为了明确ABCC2基因突变对Cry1Ac抗性的贡献，通过遗传杂交和分子标记选择从LF60品系中分离出仅具有ABCC2突变的抗性品系, 并命名为LFC2。我们发现LFC2品系与敏感品系相比，其对Cry1Ac毒素没有抗性，但是对Cry1F毒素具有抗性。本研究表明棉铃虫ABCC2基因不同的突变类型可能导致不同的抗性谱。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1供试昆虫 3
1.2 供试药剂4
1.3 试验方法4
1.4 数据处理4
2结果与分析4
2.1从LF60品系中分离出LFC2品系4
2.2 LFC2品系对Cry1Ac毒素的抗性5
2.3 LFC2品系对Cry1F毒素的抗性 6
3.讨论6
致谢 7
参考文献 7
棉铃虫ABCC2基因突变品系的分离及其对Cry毒素的抗性测定
引言
引言
转基因作物是农业史上最具争议的技术之一。现今存在的转基因农作物可以分成四种类型：一是Bt农作物，因为这种类型的农作物能够产生对田间害虫有毒的蛋白，所以可以防治害虫的侵入与对各种农作物的危害，减少在田间杀虫剂等药物的使用量，而且这种蛋白存在于土壤微生物苏云金芽孢杆菌当中。二是抗除草剂农作物，此种农作物对除草剂具有抗性，所以药物对其生长状况以及生理没有很大的影响；三是抗病毒农作物，这种农作物对花叶病，病毒病等各种病毒病害有抗性；四是营养增强型农作物，这种农作物中具有特定的营养成分和营 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
养元素而且其中维生素的含量很高；经过这么多年的转基因农作物的钻研与研究，科学家们早就已经将苏云金牙孢杆菌中的杀虫蛋白转入到棉花，玉米，大豆等各种农作物当中，从而加强对农业病害害虫的防备和防治工作[1]。研究发现，这种Bt毒素能够杀死一些具有破坏性的害虫，但是它不会像广谱杀虫剂那样具有渗透性，也不具有很强的胃毒作用和触杀作用，所以它们对其他生物比如说对人类是几乎无害的。Bt作物最早是1996年起成了商业化种植的转基因农作物，之后大规模的种植Bt棉花破坏了棉铃虫在各种作物上时刻转换寄主从而造成多寄主存在的食物链，压缩了棉铃虫在食物链上的生态位的存在优势，从而有效控制了棉铃虫对棉花的各种危害。Bt作物能够表达Cry1家族中的单种Cry毒素，从而能有效地防治某些鳞翅目的害虫。然而，因为快速发展的害虫对各种药物产生的抗性，尤其是对单种Bt毒素产生的抗性，逐渐威胁着这种环保、健康、经济的Bt作物。面对这种情况，为了延缓害虫的抗性以及扩宽害虫防治谱，新拥有的“第二代”Bt作物应运而生，此种Bt作物能够表达两种或多种Bt毒素，尤其是表达Cry2家族的Cry2Ab，Cry2Ab和Cry1毒素经常结合在一起使用,更好地用于杀死作物害虫。例如，种植同时表达Cry1Ac和Cry2Ab的Bt作物在种植Bt作物的各个国家的比例如下，2011年澳大利亚的比例为94%，2012年美国的比例为69%，2013年印度的比例为91%。昆虫摄取Cry毒素后，其能够与中肠受体结合，发现钙粘蛋白是Cry毒素在鳞翅目及鞘翅目等多种田间害虫中肠上的受体，此受体在Bt毒素发挥杀虫活性的过程当中具备重要的功能，所以毒素在中肠受体上结合后能够导致昆虫的死亡，但是这个过程中的几个步骤仍然没有完全研究透彻。鳞翅目昆虫当中多个Bt受体已经被验证，钙粘蛋白（CaLP）是其中之一，在棉铃虫、小菜蛾和烟芽夜蛾上都发现了这个受体突变与抗性有相关性。然而，不是说所有的Bt抗性都是这种受体基因的突变，研究者们通过研究发现ABC转运蛋白在昆虫对Bt毒素产生抗性过程中同样地发挥着重要的作用。
Bt毒素被广泛应用于杀虫剂等农药当中，Bt细菌所产生的杀虫Cry和Cry蛋白广泛地用于不同田间害虫的生物预防和田间防治工作中，从而发现，Cry毒素基因在转基因抗虫作物中是必不可少的存在。所以说，Cry毒素是各种农业害虫防治工作中应用最多的毒素。不过，频繁的利用Cry毒素后招致了害虫对Cry毒素拥有了了不同程度的抗性，这样的结果则直接威胁Bt作物的可持续性(Tabashnik et al., 2013) [2]。大部分昆虫对Bt作物产生的抗性是因为在Cry毒素作用机制中的分子发生了不同程度的突变(Ferre and Van Rie, 2002; Griffitts and Aroian, 2005)。因此，了解Cry毒素的作用模式还有害虫的分子以及昆虫跟毒素之间的作用模式相关的结构很是重要，因为这可能会领导预防害虫进一步产生抗性进化的抗虫策略的进步。毒素和受体互作是Cry毒素特异性结合过程中最重要的一步，发现Cry毒素有很多候选受体，已经报道候选受体的包括钙粘蛋白(Vadlamudi et al., 1995; Nagamatsu et al., 1998)，APN (Yaoi et al., 1997; Luo et al., 1997),ALP (Arenas et al., 2010; Ning et al., 2010) [3]。钙粘蛋白受体和ALP则被报道出给予Sf9细胞Cry1Ac毒素敏感性 (Nagamatsu et al., 1999; Hua et al.,2004)。除此之外，APN被报道出给予Sf21细胞Cry1Ac毒素敏感性(Sivakumar et al., 2007)。在活体研究过程中，在果蝇中使用异源表达系统发现烟草天蛾APN1给予果蝇对Cry1Ac毒素的敏感性（Gill and Ellar，2002）[4]。
ABC transporter是一种蛋白质超家族的一个成员，是细菌质膜上的一种运输ATP酶，负责各种基质利用ATP能量跨膜移动。2010年，在烟蚜夜蛾中ABCC2被发现，也被证实这是导致抗性（大于10000倍）产生的原因 (Gahan et al., 2010) [5]。至今，跟ABCC2相关的对Cry1A的抗性已经在七种鳞翅目害虫中被报道出来 (Baxter et al., 2011; Atsumi et al., 2012; Park et al., 2014;Xiao et al., 2014; Tay et al., 2015)。此外，通过RNAi干扰ABCC3后，斜纹夜蛾和甜菜夜蛾细胞系则对Cry1Ac毒素的敏感性会降低(Park et al., 2014; Chen et al., 2015)。
Shogo Atsumi（2012年）选择使用家蚕作为模型，实验通过定点克隆验证了15号染色体上对Bt Cry1Ab毒素产生隐性抗性的候选基因BGIBMGA00779293，此候选基因在能够中肠中表达，那之后又编码出了一个与人类多药耐药蛋白4近似的腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATPbinding cassette transporter），直系同源基因与烟蚜夜蛾和其他两种鳞翅目昆虫对Cry1Ac抗性有相互关系。实验中对10头敏感家蚕和7头抗性品系家蚕通过测序发现抗性等位基因中跨膜结构的外域有一个常见的酪氨酸插入。在此次实验中通过使用种系转换将一个家蚕抗性品系转变为敏感品系，证明了ATPbinding cassette transporter 基因的作用[6]。

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