烟草的整个生长发育过程中遭受多种病虫害，其中由烟草疫霉（Phytophthora parasitica）引起的烟草黑胫病，在全国各大植烟区均有发生，每年都造成巨大的经济损失。MYB家族是是植物中最大的转录因子家族之一，调控植物生长代谢、生物和非生物胁迫等过程。在之前的研究中，我们发现了本氏烟的一个MYB家族的转录因子—NbMYB57，在植物抗病过程中发挥着重要作用。为了弄清楚该转录因子抗病机制，我们首先需要获得该基因在拟南芥中的同源基因AtMYB57的突变体材料和NbMYB57的转基因烟草。本研究对其拟南芥突变体进行鉴定，选出阳性突变体植株并接种辣椒疫霉（Phytophthora capsici），对其发病情况进行观察和测量。研究发现AtMYB57拟南芥突变体接种辣椒疫霉48h后其病斑面积明显大于野生型(WT)和其他突变体。由此证明，转录因子MYB57正调控拟南芥的抗病性。构建转录因子NbMYB57的植物表达载体，经农杆菌介导的烟草稳定转化以获得NbMYB57转基因烟草。本实验借助拟南芥突变体进一步验证了MYB57 基因的抗病性，为之后进一步研究MYB57的抗病机制提供了宝贵的试验材料。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 5
1.1供试材料及试剂 5
1.1.1植物材料 5
1.1.2菌株与质粒 5
1.1.3培养基的配制 5
1.1.4各种储备液的配制方法 5
1.2拟南芥突变体的筛选和验证 6
1.2.1拟南芥的培养 6
1.2.2拟南芥突变体DNA的提取 6
1.2.3拟南芥突变体的PCR检测 6
1.2.4 PCR产物电泳检测 7
1.3接种病原菌实验和抗病性测定 8
1.3.1疫霉菌的活化和接种 8
1.3.3 拟南芥叶片的抗病性分析 8
1.4 转基因烟草的获得 8
1.4.1载体构建 8
1.4.2 大肠杆菌DH5α感受态的制备（TB Buffer法） 8
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.4.3农杆菌介导的烟草稳定转化 9
2 结果与分析 9
2.1拟南芥突变体筛选和验证 9
2.1.1 拟南芥突变体DNA的提取 9
2.1.3 MYB57突变体接种病原菌辣椒疫霉的表型分析 13
2．2 烟草的稳定转化 14
2．3 转基因烟草植株筛选 14
3 讨论 14
致谢 15
参考文献： 16
抗疫病转录因子MYB57拟南芥突变体的鉴定及其转基因烟草的获得
植物保护 周雨佳
引言
引言
疫霉属（Phytophthora）隶属于茸鞭生物界（Stramenopilia）卵菌门（Oomycete），能引起许多严重植物病害。其中的辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、寄生疫霉（Phytophthora parasitica，又称烟草疫霉）和橡树疫霉（Phytophthora ramorum)等病原菌寄主范围非常广泛，它们可以侵染多种经济作物，造成的损失难以估量[1]。由烟草疫霉引起的烟草黑胫病发生较为普遍，危害也很严重，同时该病原菌除了为害烟草外，还可以为害多种作物，是影响农作物高产、稳产的重要因素，造成巨大的经济损失。由于疫霉属病原物和真菌的亲缘关系较远，因此针对真菌病害的杀菌剂对于疫霉属病原物往往效果不佳，很多疫霉对这些杀菌剂都产生了抗性，在生产中就需要依靠抗病品种的培育来防治病虫害。目前，防治烟草病害的方法主要是药剂防治和选育抗性品种。但由于而药剂防治对环境污染严重且投入大、效果差。因此，筛选抗病基因并培育抗病烟草品种在综合防治烟草病害方面就成为最经济有效的方法[2]。
转录因子是指能够直接或间接与启动子核心序列TATA盒特异结合，并启动转录的一类调节蛋白，通过调节目的基因的转录效率来调控植物的生理生化过程。根据DNA结合区域的不同，如螺旋一环一螺旋、锌指结构、螺旋一转角一螺旋和亮氨酸拉链结构等等，植物的转录因子可划分成多个家族，如NAC家族、MYB家族、WRKY家族等[3]。植物在应对生物胁迫时，通过不同信号分子经由不同的传递途径，激活相关抗病相关转录因子的活性，这些转录因子与下游调控基因的启动子区的顺式作用元件结合，从而调控特定基因的表达，基因表达的结果是对外界胁迫信号做出调节反应，实现植物对病原菌的抗性[4]。转录因子调控的是一系列下游基因的表达，而不是单个的基因。因此，利用转录因子来提高植物的抗性就显的更高效。当植物处于胁迫环境时，同一种逆境胁迫可以同时激活多条途径，从而有多个转录因子参与调控。而同一转录因子也可能会由多种胁迫激活，如Tsi1基因在盐、伤害和 SA 等处理后迅速被诱导表达[5]。
MYB类转录因子的共同特点是其结构上都有一段保守的DNA结合区，即MYB结构域。MYB转录因子结构域的N端区域都是高度保守的，且该结构域由13个串联的且不完全重复的R结构(R1, R2和R3)组成。R结构是由50个左右的氨基酸组成的折叠蛋白，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列，其中氨基酸残基以螺旋一转角一螺旋(HTH)的形式参与到与DNA的结合过程[6]，间隔序列则由一个色氨酸残基组成，每隔18个氨基酸会间隔着一个色氨酸残基，这个色氨酸起着疏水核心的作用，对维持HTH的构型具有重要意义[7]。
为了应对恶劣的生存环境，植物进化出了比较完善的胁迫应答反应，其中MYB转录因子在该过程中起着承上启下的作用。自1987年PazAres等第一次正式报道了玉米转录因子的克隆以来，各种研究结果表明，植物中所含有的大量控制主要发育性状和代谢性状的基因，其编码产物均为转录因子[8]。目前在多个植物中发现有超过2万个MYB转录因子，数量庞大且功能多样的MYB转录因子蛋白能广泛参与植物的初生和次生代谢过程的调控，例如影响细胞进化和周期、初级和次级代谢反应、形态建成和发育并在抵抗生物和非生物胁迫中起作用[9]。MYB基因家族中大多数成员在调控某些生理生化过程中起起正调控作用，以其在响应植物逆境过程为例，MYB基因表达量越高，其抵抗逆境的能力越强[10]。由于植物MYB转录因子基因表达调控方式众多，还参与多种生物学过程，几乎涉及到植物代谢发育的各个方面[11]。同时，MYB转录因子不仅参与抗胁迫，也参与植物抗病的过程。如小麦的TaPIMP1，拟南芥的AtMYB46, AtMYB72, AtMYB73转录因子分别能对斑病菌、灰霉病菌、根腐离蠕孢菌的入侵作出应答调节[12]，而拟南芥AtMYB96通过调控水杨酸合成途径提高抗病能力。Yang等从烟草中分离得到一个TMV诱导性的MYB基因NtMYB1，第一次说明了关于MYB基因参与植物病原互作过程及诱导抗病基因表达，证明NtMYB1可以特异性结合PR1a基因启动子中的MYB结合位点，从而调控PR1a基因的表达[13]。然而迄今为止，未见有关MYB转录因子抗疫霉的相关报道。

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