V-ATP酶（V-ATPase）由膜融合结构域V0和催化结构域V1组成，是一种ATP驱动的质子泵。V-ATPase基因表达受抑制时昆虫的多种生理活动异常，利用RNAi技术干扰二斑叶螨中V-ATPase基因后螨虫的生长发育受到影响。通过在二斑叶螨上对五种不同RNAi方法进行对比，结果表明浸泡法效率最高。本实验以安徽滁州截形叶螨种群作为代表种群，利用RNAi浸泡法对V-ATPase基因A亚基进行干扰，并以水浸泡和正常生长作为对照，结果发现V-ATPase基因受干扰后截形叶螨产卵量较对照组显著减少。利用RNAi技术干扰叶螨中V-ATPase基因可以研究其在生长发育中的作用，为螨虫防治提供新的思路。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1. 材料与方法2
1.1 供试材料2
1.2 叶螨总RNA的提取 2
1．3 反转cDNA3
1．4 VATPase基因PCR扩增及dsRNA合成3
1.4.1 VATPase基因的体外扩增和产物切胶回收 ......3
1.4.2 dsRNA合成....4
1.5 RNAi浸泡法..5
2. 结果与分析5
2.1 截形叶螨总RNA质量检测结果5
2.2 VATPase基因的序列 .5
2.2.2 VATPase基因扩增所得序列....5
2.2.2 截形叶螨VATPase基因与二斑叶螨的VATPase基因对比.....5
2.3 RNAi干扰的结果..6
3.讨论 7
致谢8
参考文献8
截形叶螨中VATPase基因沉默对其生殖影响
引言
截形叶螨（Tetranychus truncates Bhara）又被称为截头叶螨，属蜱螨目叶螨总科叶螨科[1,2]。截形叶螨在国内分布广泛，北京、内蒙古、新疆、山东、广东、河北、江西、陕西和台湾等地均有发现。截形叶螨在我国长江流域及其以南的地区每年发生15至20代，在西北和华北每 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
年发生10至15代[3]。温度是影响截形叶螨种群消长的重要气候因素，温度能够决定其发生的早晚及一个世代所需的时间长短[4,5]。开春以后随着气温的逐渐升高，螨虫的繁殖速度加快，6月至8月是截形叶螨大发生期，期间平均温度越高则发生的世代数越多。截形叶螨能寄生多种植物，如玉米、麦类、和高粱等粮食作物，棉花、蓖麻、芝麻等经济作物；此外，截形叶螨也能为害苹果、杨、柳、月季、牵牛花、狗尾草和洋紫荆等植物[6,7,8]。在众多的寄主中玉米受害较为严重，且截形叶螨常常与二斑叶螨、朱砂叶螨混合为害，其中截形叶螨是主要为害螨虫，而且在天热少雨的季节或干旱的年份玉米受害较重。
近几年来，由于不科学地大量使用化学药剂，导致农田生态平衡失调，害虫种群数量发生变化，农业螨虫由次要害虫上升为主要为害作物的害虫，截形叶螨是其中之一。截形叶螨以口针刺吸植物汁液，取食时将其口针刺入叶片的下表皮细胞，并从栅栏组织和海绵组织处吸取营养物质[9]。截形叶螨为害后对寄主造成多种伤害，取食对植物组织造成机械损伤，叶片净光合作用率降低，最终导致寄主减产甚至死亡。研究表明，当寄主的单株截形叶螨数量分别为100头、300头、500头、700头、900头时，为害所造成的损失率分别为13.7 %、20.4 %、26.7 %、36.6 %和47.3 %[10]。螨虫繁殖能力强，且易产生抗药性，如何科学、有效地防治截形叶螨成为一项重要的课题。
RNA干扰（RNAi）是双链RNA（dsRNA）对基因表达具有强烈的抑制效应的现象，目前已在植物、昆虫和线虫等许多真核生物中发现存在RNA干扰致使基因沉默的现象[11,12]。RNAi技术特异性强、效率高，因此RNAi被当作分析基因功能的有效工具[13,14]。Chen等运用显微注射法将几丁质合成酶基因的dsRNA导入甜菜夜蛾中，实验组甜菜夜蛾体内几丁质含量较低，相比于对照组死亡率更高；由此推测几丁质合成酶在甜菜夜蛾的生长发育中起着至关重要的作用[15]。VATPase由V1催化结构域和膜融合V0结构域组成；V1催化结构域由A ,B、C、D、E、F、G、H 等8个亚基组成，V0结构域由a、c、c＇、c＇＇、d、e等6个亚基构成VATPase通过利用ATP水解时释放的能量，驱动转子旋转将H+泵出或泵入细胞，从而保证细胞处于生长所需的pH值范围[16,17,18]。VATPase存在于多种原核和真核生物中，并在昆虫的生存及繁殖等过程中起着非常重要的作用，VATPase基因表达受到抑制时昆虫生长缓慢甚至死亡，如烟粉虱VATPase 的A亚基受干扰后死亡率高达85.62%[19]。
随着VATPase的化学结构被发现，以 VATPase基因为靶标基因，利用RNAi技术对其进行干扰，致使昆虫靶标的mRNA降解，从使起昆虫物质合成受阻、死亡率上升，这为害虫防治提供了新的方法。Baum等人将玉米根虫VATPase A亚基的dsRNA基因导入玉米并使其在生长中表达，结果显示获得转基因的玉米能使其免受玉米根虫的为害[20]。Li等利用RNAi技术沉默东亚飞蝗VATPase的H亚基基因，处理后的东亚飞蝗个体蜕皮过程受阻，死亡率较正常显著增高，死亡率高达95% [21]。Suzuk 等人利用五种（叶片悬浮法、叶片包被法、人工饲喂法、转基因植物表达法及浸泡法）不同的RNAi方法对二斑叶螨的VATPase基因进行研究，结果显示不同的RNAi方法对二斑叶螨影响不同。叶片包被法和浸泡法处理螨虫后虫体体色变黑、死亡率显著增高，且浸泡法效率最高[22]。本实验利用RNAi技术对截形叶螨的VATPase基因进行干扰，实验使用浸泡法对截形叶螨雌成虫进行处理，观察记录处理后螨虫的存活情况及其产卵量。本实验对截形叶螨中VATPase的功能做了初步研究，为RNAi防治叶螨提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
为了研究VATPase基因沉默对截形叶螨生殖的影响，我们用截形叶螨安徽滁州种群作为代表种群，我们利用ITS基因测序和单雌系培养最终得到稳定遗传的截形叶螨种群来进行试验，并将截形叶螨种群在菜豆 Phaseolus vulgaris L. 叶片上进行隔离饲养。饲养条件为25±1℃，相对湿度为60%，光照周期为 16L8D[23]。

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