由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是世界各地辣椒种植区普遍发生的一种毁灭性土传病害[1]。到目前为止还没有可以有效防治该病害的有效药剂研究出来。本研究以实验室往年分离保存的一株具有生防作用的地衣芽孢杆菌( Bacillus licheniformis )BL06为研究材料，以辣椒疫病为研究对象，测定菌株BL06的随机突变体对辣椒疫霉孢子囊发育和生长的影响，明确其对辣椒疫病的生防作用的相关功能基因，初步解析其抗菌机制，为辣椒疫病的生物防治和该生防菌BL06的深入开发应用提供理论依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1实验材料 2
1.1.2培养基 3
1.2研究方法 3
1.2.1突变体菌株库的制备3
1.2. 2 用突变菌体对辣椒疫霉进行处理5
1.2.3根据辣椒疫霉孢子囊的发育情况进行相应菌株筛选5
1.2.4相关功能基因的克隆5
2 结果与分析6
3讨论 6
致谢6
参考文献6
地衣芽孢杆菌BL06抑制辣椒疫霉孢子囊发育和形成的相关功能基因的克隆
作者：王鹏
引言
引言 辣椒疫霉在新墨西哥的拉斯维加斯CRU的农业研究站被Leon H. Leoni 首次描述，给辣椒造成了相当大的损失[1]。辣椒疫病是一种世界毁灭性的土传病害，是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)所侵染的而引起的。辣椒疫霉菌产生卵孢子，其卵孢子具有抗逆性、忍耐极端环境条件的能力，他们对外界的有害因子抵抗力强，分布广，广泛存在于土壤、水、空气及动物肠道等处，这也使该病害成为最难防治的土传病害之一[4]。该菌通过孢子囊在田间传播，条件适宜时，侵染速度极快，极易在短时间内造成大面积流行，导致大面积减产甚至绝收。此外由于疫病菌的群体变异复杂导致疫霉对杀菌剂极容易产生抗药性，而且化学杀菌剂的大量使用，容易对环境产生破坏，危害生态安全 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
，因此急需寻求新的防治措施[2]。
当前一般情况下，植物病害的防治方法还是以抗病品种的培育和化学农药的防治为主。由于化学类药剂在农业生产中的长期过度使用，严重破坏了我们的生态环境，使人类健康面临着巨大的威胁。为了绿色农产品的开发和可持续农业的发展，也需要我们去探索一条新的防治路线。生物防治能控制疫病的发生，对人畜安全，不会引起环境污染，还能加强植物的防御能力，具有很大的发展潜力[3]。其中就包括生物防治细菌的应用。这些活体微生物成功定殖在植物体内或体表，通过代谢产物直接抑菌、诱导植物产生系统抗性、促进植物生长等机理来防治植物病害[4]。
芽孢杆菌能形成芽孢，这类细菌以芽孢形态广泛存在于各种自然环境中，可以在一些恶劣的环境中生存，且能分解利用环境中一些其他微生物难以分解的矿物质，从而应用于生防作用中[5]。而芽孢杆菌作为生防细菌被人们研究较多，因为其不仅有防病作用，而且具有明显的促生增产效果[6]。由于已有实验证明地衣芽孢杆菌BL06对辣椒疫霉孢子囊的发育具有抑制作用，若可以筛选出并克隆其控制生防作用的相关基因，则会对辣椒疫病的防治找到新的突破口径。
本实验即是对相关方面就行研究探索，利用实验室中保存的具有生防作用的地衣芽孢杆菌，获得随机突变体并对辣椒疫霉进行处理，通过观察辣椒疫霉孢子囊的发育情况，从而筛选出相应的突变体，进而克隆相关基因。
1 材料与方法
1.1材料
实验材料
实验菌株
特性
来源
BL06（pMarA）
TnYLB1、ErmR以及KanR
实验室保存
BL06
野生型
实验室保存
Phytophthora capsici
野生型
实验室保存
引物
序列
用途
Kanamycin(kan)F
TCCCCAGTAAGTCAAAAAATAG
Kan基因的检测
Kanamycin(kan)R
ATCAGGCTCTTTCACTCCATCG
Kan 基因的检测
培养基
LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，定容至1 L，PH = 7.07.2，添加15 g/L琼脂，在120 ℃ 高温下灭菌20 min.
V8培养基（蔬菜汁培养基）：100 ml v8蔬菜汁（纱布过滤），1g CaCO3定容至1 L，15 g/L琼脂，120 ℃ 灭菌20 min.
1.2 方法
1.2.1 突变体菌株库的制备
背景和基础 转座因子是一类在生物体中广泛存在的遗传因子。一段序列从供体基因组中通过复制或者断裂形成，并通过一系列转座辅助因子的作用下，插入标靶序列中进行正常拷贝，此过程称为转座[7]。伴随着分子生物学与基因工程的研究不断地深入和推进，在发现和克隆功能基因的研究中，深入改造与利用转座子元件，也成为了研究基因功能有力的工具。其中最为重要的一点是因为转座子元件具有随机插入染色体基因组的功能特性，使越来越多的转座子元件被发现并且应用于生物突变体的构建过程中，以进行未知功能基因的挖掘以及生物遗传功能和特性等研究[8]。在植物病理学领域中，对生防细菌的生防机制以及病原菌致病机理、调控因子等的研究逐步增加。而要把外源DNA（转座因子）插入宿主细胞中，首要条件就是要使得宿主细胞处于感受态。众所周知，在细菌的转化和感受态的制备获得等方面，氯化钙转化法是最常见的方法，随后越来越多更高效的化学感受态制备法得到发掘和利用，遗憾的是这些方法对于芽孢杆菌各菌株的转化却没有利用价值。过于丰富的酶系统、过厚的细胞壁、较低的感受态形成率是芽孢杆菌菌株转化效率低下的最主要原因。另外在在原生质转化中，会发生细胞壁的破损从而导致细胞功能紊乱，令染色体相关酶缺失，从而外源DNA无法被菌体接受。之后，随着另一系列的转化方法得到深入开发，比如高渗透电转化法、原生质诱导转化法以及原生质体的电转化法等方法[9] 。其中原生质体电转化法凝聚了原生质法和电转化法的长处，利用溶菌酶溶解细胞壁获得了原生质体，从而减少的转化障碍，并利用电机原生质体使得细胞穿孔，有利于载体进入[10]。在转化效率方面，原生质体的电转化法要高于前两者。与此同时，由于芽孢杆菌各菌株本身具有较低的转化效率的特点，尤其是野生型菌株，使前面的很多方法都无法奏效，从而该方法变得更加重要可行[11]。本实验所采用的的地衣芽孢杆菌BL06（pMarA）即是通过此方法获得转化。

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/561568.html