灰飞虱（Laodelphax striatellus）是重要的水稻害虫之一，不仅可以通过刺吸危害作物，还可以传播多种植物病毒。由于长时间大量、不合理地使用农药，灰飞虱对多种杀虫剂都产生了抗性。昆虫体内细胞色素P450酶作为重要的解毒代谢酶，在灰飞虱抗药性的产生过程中起到重要作用，也是目前研究最多的解毒代谢酶。本文在前期利用转基因技术及UAS/GAL4表达系统将灰飞虱P450基因导入果蝇体内使其超量表达的基础上，利用生物测定的方法用吡虫啉处理这32个转基因果蝇品系，以期望能够快速筛选出与吡虫啉抗药性相关的灰飞虱P450基因。结果表明32个品系中有7个超量表达的果蝇品系对吡虫啉的敏感性显著降低，初步说明这7个P450酶在吡虫啉的代谢过程中起作用，为进一步基因的功能验证提供了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1材料与方法2
1.1供试昆虫 2
1.2 昆虫的饲养 2
1.2.1培养基的制备3
1.2.2果蝇的饲养3
1. 3供试农药3
1. 4杀虫剂的制备4
1. 5试验方法4
2结果与分析4
3讨论 8
致谢9
参考文献932个超量表达灰飞虱P450基因的果蝇品系对吡虫啉的生物测定
引言
引言
灰飞虱是水稻上的重要害虫之一，它的危害除了表现为以成虫或若虫的形态直接刺吸寄主植物汁液，更严重的是它可以作为传播媒介间接传播多种植物病毒病害［1］。近年来，灰飞虱的发生量逐年上升，严重地影响我国农作物的生产以及农田生态安全［2］。
灰飞虱是典型的r对策型害虫，对环境有着较强的适应能力，尤其是在环境适宜的情况下，它的种群数量增长极快，极易猖獗［3］。灰飞虱传播的多种植物病毒病给农作物带来巨大的威胁，严重地影响粮食的安全生产。一般而言，杀虫剂见效快，作用明显。因此，化学防治成为了防治灰飞虱的主要手段［4］。由于长期大量、不合理地使用化学杀虫剂，导致了灰飞虱对多种类型农业生产中常用的杀虫剂均产生抗药性，并在有机磷类、拟除虫菊酯类 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
、氨基甲酸酯类和新烟碱类农药表现出了交互抗性［5—6］。
在昆虫的生长发育以及对环境的适应过程中，昆虫的细胞色素P450 酶系起着重要作用。P450不但可以代谢掉一些内源性生理物质，例如保幼激素等［7］，还可以将杀虫剂等多种异源有毒物质代谢掉。随着深入研究发现，细胞色素P450酶系与昆虫抗药性关系主要是通过P450在转录水平上过量表达或者氨基酸序列的突变来增强酶对于杀虫剂的解毒代谢活性。
果蝇Drosophila melanogaster是遗传学上一种重要的模式生物。果蝇在遗传操作上具有许多优势，常常被作为转基因的对象，用于生物学的各领域研究，因为果蝇具有体积小、生命周期短和繁殖力强、易于饲养、染色体数目少、操作方便、易于进行表型分析研究等特点。本实验在已获得32个超量表达灰飞虱P450基因果蝇品系的基础上，利用生物测定的方法，定性的分析了灰飞虱P450基因的过量表达与吡虫啉抗性的关系，为灰飞虱P450介导的代谢抗性研究提供了新的思路和方法。
1 材料与方法
1．1 供试昆虫
32个超量表达转灰飞虱P450基因的果蝇品系均为实验室前期所建立，生物测定对照品系为9755与GAL4的杂交品系，其遗传背景与超量表达品系完全一致。
2 昆虫饲养
1.2.1 培养基的制备
果蝇以酵母菌为食，常见培养果蝇的培养基有玉米粉培养基、香蕉粉培养基等[8]。本实验室用的是玉米粉培养基，其成分为：玉米粉、琼脂、白糖、酵母、尼泊金甲酯、水（具体配方见表1）。具体操作步骤如下：将水分成两份，大部分加热煮沸，取部分沸水烫酵母粉，将白糖与琼脂倒入锅内后搅拌均匀；另一部分凉水状态倒入玉米面，将其搅拌均匀成玉米糊状态后倒入锅中，搅拌均匀，沸腾后关掉电源。培养基温度降到75℃左右时,将沸水烫好的酵母粉和尼泊金甲酯倒入,搅拌均匀。将培养基分装到各培养瓶中,每瓶装至1.5～2 cm的高度即可。待培养基凝固后，用灭菌后干燥的棉花塞塞住瓶口。
表1 玉米粉培养基配方
成分
含量
玉米粉
17g
琼脂
1.5
白糖
13g
酵母
4.5g
尼泊金甲酯
0.6g
水
200ml
培养基的分装量视培养瓶容积而定，一般高度在1.5～2cm为宜，如果培养基太少容易失水干燥，太多的话果蝇活动空间会受限制，不利于繁殖。需要长期保种培养时，可选用体积较小的果蝇管分装培养基，但不要超过其容积的1/3。待培养基冷却凝固后，将需要的果蝇转移至果蝇管中进行培养繁殖[9]。
1.2.2 果蝇的饲养
果蝇果蝇能够正常地生长发育的最适培养温度为2025℃。但培养果蝇的温度也需要根据实验目的的不同进行适当调整。例如：果蝇保种时，为了利用低温延长果蝇的生活史，减缓生理代谢，降低资源消耗，应该将温度控制在15℃左右；做果蝇的杂交试验时，为了加快实验进程，需要提高温度至2527℃，在这个温度条件下，果蝇的代谢活动会增强，生活史会缩短，世代间隔缩短。
1．3 供试农药
97%吡虫啉原药，由南京红太阳集团生产。该药是一种新烟碱类内吸杀虫剂，有微弱气味，易溶于二氯甲烷，是烟碱乙酰胆碱受体的作用体。它可以干扰害虫运动神经系统导致化学信号传递失灵，具有触杀、内吸、胃毒作用，害虫接触药剂后中枢神经正常传导受阻，最后麻痹死亡。
1．4 杀虫剂的配制
以丙酮（分析纯）为溶剂，将杀虫剂原药配制成浓度为10,000 mgL1的母液。根据预实验确定适合的杀虫剂的浓度，然后用丙酮按一定倍数梯度稀释杀虫剂，用于生物测定。
1．5 试验方法
生物测定法(bioassay) 是根据“药剂作用方式和昆虫种类”建立标准的一种抗药性检测方法[10]。点滴法是生物测定法的一种，用微量点滴仪、毛细血管或微量注射器将一定浓度的药液点滴在虫体的一定部位，如胸部背面或胸部腹面，药液进入虫体后而产生触杀作用。一定时间后检测试虫的死亡个数。点滴法适用于触杀作用的杀虫剂。
本实验在FAO点滴法的基础上，参照Nagata的微量点滴方法[12]，结合本实验的具体情况进行改进。待实验果蝇羽化为成虫后，选取4~5日龄雌性果蝇作为供试果蝇。吡虫啉药液以20头试虫为一组，每个浓度设3组重复。将供试果蝇分成若干组，每组10头。将果蝇放置于通有CO2的果蝇管中，麻痹1min左右。迅速用将麻痹后的果蝇平铺于托盘上，用毛刷轻轻按住果蝇，用自动微量点滴仪（Burkard公司）通过微量注射器将吡虫啉点滴于果蝇的前胸背板处，每只试虫点滴0.04µl。更换不同浓度药剂时，应用丙酮将注射器和针头洗涤5~6次，然后量取待测农药。

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