裂荚是大豆的一种自然特征属性，也是栽培大豆产量损失的主要原因之一。本研究是在通过GWAS得到大豆裂荚候选基因Glyma02g47200的基础上，对其进行基因全长克隆，序列分析的结果表明该基因是编码一个C3H2C3类型的RING蛋白，将其命名为GmRNF2a（RING finger protein）。通过实时定量RT-PCR分析发现GmRNF2a在各个组织都表达，是一个组成型表达的基因，利用拟南芥原生质体瞬时表达系统进行GmRNF2a亚细胞定位研究，并将候选基因在拟南芥中进行了遗传转化。亚细胞定位的结果显示该基因编码的蛋白主要定位于细胞质；通过拟南芥过表达GmRNF2a，发现转基因植株与对照植株在表型上没有显著的差异，拟南芥角果的发育与对照没有显著差异，角果也没有提前开裂，但有些转基因株系的千粒重和总氨基酸含量有显著提高。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2试剂与仪器 2
1.3 GmRNF2a基因cDNA全长的克隆3
1.4 GmRNF2a基因序列及氨基酸序列分析3
1.5 GmRNF2a组织表达分析3
1.6 GmRNF2a的亚细胞定位4
1.7 GmRNF2a在拟南芥中过表达4
2 结果与分析5
2.1 GmRNF2a基因cDNA全长的克隆5
2.2 GmRNF2a多序列比对分析5
2.3 GmRNF2a在大豆中的组织表达分析6
2.4 GmRNF2a的亚细胞定位6
2.5 GmRNF2a转基因拟南芥阳性植株的检测7
2.6 GmRNF2a转基因拟南芥千粒重和氨基酸含量的测定8
3讨论 9
致谢9
参考文献10
大豆裂荚相关基因GmRNF2a的克隆及功能验证
引言
引言
裂荚是野生大豆的一个典型生理特征。Harpe[1]形象地把在特定生长阶段大量种子从植株上降落的现象描述为种子雨。但是裂荚也是大豆生 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
产中的一种不良现象，严重影响着大豆收获产量。大豆裂荚的发生给国内外大豆产业均带来了十分严重的损失。因此，大豆裂荚发生的分子遗传基础方面的研究不仅具有理论意义，更具有潜在的实际应用价值。
豆科植物荚果由单个折叠的种子心皮所形成。大豆在完熟期时，由于豆荚中的水分含量相对较低，导致豆荚的内生厚壁组织层细胞的张力产生变化，荚皮围绕着与内生后壁组织层的纤维方向的平行轴呈螺旋扭转而卷曲，进而将连接着背、腹缝线的薄壁组织拉裂开来，最后，荚皮开裂的现象称之为裂荚[2,3]。
随着生物技术的迅速发展，RAPD(随机扩增多态性)、RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)、AFLP(扩增片段长度多态性)、SSR(简单重复序列)[4]、SNP（单核苷酸多态性）等大量分子标记应运而生，这些标记已在大豆裂荚QTL定位研究中广泛应用。1997年，Bailey等[5]以美国的栽培大豆品种Young与野生大豆PI416937为研究对象，运用RFLP标记技术构建了大豆的遗传连锁图谱，首次鉴定出控制大豆裂荚的1个主效QTL，该QTL位于16号染色体；Funatsuki等[6]于2006年利用裂荚性状差别较大的两个栽培大豆构建RIL群体进行QTL分析，验证了1个主效QTL，并将其命名为qPDH1；2013年Gao等[7]利用已报道的定位信息，重新创制了Young与野生大豆PI416937的RIL群体，并通过开发的12个SNP(单核苷酸多态性)，将qPDH1锁定在SNP6与SNP10之间的47 kb的区域范围内，并预测出Gm16g25610与Gm16g25600两个基因。2014年，Funatsuki等[8]图位克隆了16号染色体已报道的QTL“qPDH1”附近的基因pdh1，并明确了该基因在干旱或半干旱地区对抗裂荚性状的重要作用；2014年董阳等人[9]以抗裂荚品种黑农44与裂荚的野生大豆ZYD00755为研究对象，在16号染色体的116 kb区域内，克隆了一个抗裂荚的基因，命名为SHAT15，并进一步通过实时定量PCR证明在黑农44大豆中该基因可形成抗裂荚性。
本实验室许光莉（2014）[10]和王婷婷（2016）[11] 分别对219份栽培大豆材料构建的自然群体进行大豆裂荚表型鉴定（2012至2015年4年数据），利用覆盖全基因组的1142个SNP分子标记和205对SSR分子标记采用Q+K混合模型进行了大豆全基因组扫描（P<0.01）进行大豆裂荚性状标记的关联分析。其中3年（2012，2014和2015年）重复定位到2号染色体上的1个SNP位点（BARC02004504420）与大豆裂荚性状相关联，进而搜索了这个标记前后130 Kb（自然群体的LD衰减值）范围内的基因，发现有个基因GmRNF2a属于E3泛素连接酶家族，含有RINGfinger结构域。本研究对此候选基因进行基因克隆和功能验证，以进一步了解和补充大豆裂荚相关机理和调控网络。
1 材料与方法
1．1 实验材料
Willmas82大豆材料，由大学国家大豆改良中心提供，播种于大学培养箱，人工气候条件下生长。
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5ɑ感受态购于天根生化科技有限公司；根癌农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）菌株EHA105由本实验室提供。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子由本实验室保存提供，种植于温室中。
1．2 试剂与仪器
快速限制性内切酶SspI、NdeI、BclI等和T4连接酶购于Fermentas公司（隶属于Thermo Fisher Scientific）。新型植物基因组提取试剂盒（DP320）和植物总RNA提取试剂盒（DP432）购于天根生化科技有限公司。高保真DNA聚合酶（货号：P505d1）和普通PCR Mix（货号：P21201），逆转录试剂盒HiScript Q RT SuperMix for qPCR（货号：R12301）购于诺唯赞生物科技有限公司。DNA Marker购于全式金生物技术有限公司，DNA凝胶回收试剂盒（AxygenAPGX50）和质粒DNA小量试剂盒（AxygenAPMNP50）购于Axygen。引物合成及测序工作由华大基因（上海）完成。
RXZ型智能人工气候培养箱（型号：RXZ500DLED4，宁波江南），电子天平（METTLER TOLEDO，AL104IC和PL602L），超净工作台（苏净安泰，SWCJ1FD），台式高速冷冻离心机（BECKMAN，Allegra X22R）和台式微量离心机（BECKMAN，Microfuge® 18），组织研磨器（QIAGEN，TissueLyser II），PCR仪（Biometra，TProfessiona），荧光定量PCR仪（ABI，7500），凝胶电泳仪（北京六一仪器有限公司，DYY7C）和水平电泳槽（北京六一仪器有限公司，DYCP32B），凝胶成像系统（Pharmacia Biotech Image Master），紫外可见分光光度计（南京菲勒仪器有限公司，T6）等。

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