水稻叶色突变体是一类常见且较易获得的突变类型，对水稻叶色突变体的研究有助于深入了解水稻叶色调控的生理机制，为水稻遗传改良和育种提供基础。所用材料为EMS（甲基磺酸乙酯）诱变处理常规粳稻品种“宁粳4号”获得的黄叶突变体，经多代自交后，黄叶突变性状稳定遗传。与“宁粳4号”相比，黄叶突变体植株矮小，叶片偏黄，叶绿素含量低。为了克隆该黄叶突变基因，将黄叶突变体与国外籼稻品种Dular杂交构建F2分离群体，挑选出F2中的黄叶个体用来进行基因定位。利用SSR和Indel分子标记将黄叶突变基因定位在水稻第1条染色体长臂分子近着丝粒区域的标记RM66和RM24之间，两者物理距离大约有1.7Mb。这为对该黄叶突变基因进行精细定位缩小了定位范围，减少了工作量。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 供试材料 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 植物材料的培养2
1.2.2 光合色素含量的测定2
1.2.3 DNA的提取3
1.2.4 聚合酶链式反应4
1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测4
1.2.6 RNA的提取5
1.2.7 RNA反转录cDNA和cDNA扩增6
1.2.8 候选基因的推测6
2 结果与分析6
2.1 黄叶突变体的表型鉴定6
2.2 黄叶突变体的光合色素含量下降7
2.3 农艺性状观察7
2.4初步定位分析8
3 讨论 9
3.1 宁粳4号黄叶突变体的表型鉴定和初定位9
3.2 需进一步对黄叶突变基因进行精细定位9
3.3 应用前景9
致谢10
参考文献10
一个水稻黄叶突变基因的定位
引言
水稻（Oryza Sativa L.）几乎在全中国都有种植，其果实是人们最常食用的主食。水稻是典型的单子叶植物，科研工作者常以水稻为材料研究其植物生理机制和基因组，并将研究结果合理 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
运用在其他植物的钻研和应用中。关于水稻叶色突变体的研究一直在进行，多种表现形式的叶色突变体能作为研究光合作用、叶绿素合成与降解等的良好的实验材料。Gostaffsson将叶色突变体分为斑点、条纹、浅绿、黄化、白化[1]。Awan等将其分为：条纹、淡绿、绿白、白翠、绿黄、黄绿、白化、黄化[2]。此外，还有Kusumi等依据受光条件比如光的种类、光的强弱和光照时间长短的差异影响将突变体分为依赖光诱导型和非依赖光诱导型[3]。Falbel等根据叶色突变的叶绿素差异分为总叶绿素增加型、缺总叶绿素型、缺叶绿素a和缺叶绿素b型[4]，如刘敏等报道的ygl11(t)突变体是一个缺叶绿素b型突变体[5]。根据突变体对温度的反应，刘艳霞等将叶色突变体分为低温敏感型、高温敏感型和特殊温敏感型[6]，如王文娟等报道的tcm11突变体在低温（20℃）条件下，幼苗呈黄化转黄绿表型，而在高温（32℃）下，突变体表型及其他指标又与野生型一致[7]，Liu等报道的tscd1突变体在22℃以下的低温中叶片表现明显的黄化表型，随着温度升高，黄化的叶片逐渐变绿至接近野生型[8]。吴殿星等将温敏核不育系叶色突变体分为温钝型、低温表达型和高温表达型[9]。叶色突变体的来源变得广泛使得更多新的叶色突变体接连被人们发现，根据突变体苗期的叶色变异来大致判断突变体的类型依然是简单、方便、直观且有效的方法。
据孙亚利等报道，至2015年最少有190份水稻叶色变异材料被发现，人们最少已将145个水稻叶色相关突变基因分别定位到了水稻相应的染色体上，这些基因存在于水稻的12条染色体上，其中在第3号染色体上存在最多[10]。近三年，据不完全统计至少有4个水稻黄叶突变体被报道。李威将一个黄叶突变体的突变基因定位到第1号染色体短臂中端，经过精细定位和候选基因的鉴定，获得突变基因为yl1基因，YL1基因表达一个在C端定位于叶绿体的信号肽，YL1基因突变致使黄叶表型的出现[11。焦仁军等将一个黄叶突变基因577ys定位在第1号染色体短臂上，在分子标记RM572和Z1之间，这两个分子标记之间的物理距离约为105.4kb[12]。王悦等在给水稻两用核不育系制种的自然农田发现一株天然发生黄叶突变体xws，将该突变基因定位在第3号染色体0.7cM的距离内[13]。滕炎桐等研究了一个定位于第3号染色体的黄叶突变基因与其他8个叶绿素合成关键基因的表达关系[14]。
当今，基因定位和克隆的手段越来越多，本实验采用是图位克隆（mapbased cloning）。图位克隆的研究原理是，位于同一条染色体上的不同间隔的DNA片段之间存在相应的连锁关系，与目的基因间隔越小的染色体片段在同源染色体之间发生重组交换的可能性越小，即连锁更紧。同理，离目的基因越近的分子标记与目的基因的连锁也越紧凑。由此可见，图位克隆的广泛应用建立在分子标记的开辟和图谱的创建上。之前的科研工作者们已在染色体上设置了大量，均匀分布且已知位置的分子标记，通过找出与目的基因连锁最紧的分子标记就能够初步判断目的基因在染色体上的大约位置。之后的工作就是采用染色体步移（chromosome walking）的方法逐步接近目的基因，最终准确定位目的基因并将其克隆出来。目前图位克隆在水稻[15]、棉花[16]、拟南芥[17]、大豆[18]、番茄[19]、等多种植物的钻研中都有普遍运用。
1 材料与方法
1．1 供试材料
大学水稻所之前用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变水稻品种宁粳4号，获得一个黄叶突变体，该突变体经过多代自交达到黄叶性状稳定遗传，将该突变体和国外籼稻品种Dular杂交得到F1，F1自交得到F2代，将F2代种植在南农水稻育种课题组的人工气候室。在F2代中群体筛选出与突变体表型相同的黄叶极端稻苗用来定位。
1．2 实验方法
1．2．1 植物材料的培养 将野生型、突变体和F2代种子在室温下浸种24h，种子吸水膨大至尖端露白，之后把种子装在塑料袋里密封，于30℃催芽24h，种子长出胚根。将蛭石与营养土约3：2混合均匀，加入适量水，使混合土全部湿润但表面无水层，将种子摁在土表面以下约0.3cm深的土层中。植物生长于人工气候室内，每天光照16h，黑暗8h，温度24℃，隔天浇水保持土壤湿润。
1．2．2 光合色素含量的测定 将突变体和野生型培养至14天时，取第2叶0.01g，剪碎，浸泡在2mL 95%的乙醇溶液中，立即用锡纸包裹使之处于黑暗条件下，5000rpm离心5min使叶片完全浸润于95%的乙醇溶液中，4℃放置48h，期间多次缓慢摇晃，吸取上清液，利用分光光度计，测定470nm，649nm，665nm波长下的吸光度A470、A649和A665。

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