高温胁迫会影响水稻的发育及产量，而水稻对于热胁迫的响应比较复杂，关于水稻是如何感知、转导高温胁迫的信号还有许多问题有待解决。本研究前期通过生物信息学分析得到与耐热有关的候选基因，然后利用Crispr体系产生了水稻cngc突变体材料。高温胁迫处理后，经DAB染色，离子渗漏测定等表型鉴定发现该突变体在高温处理下较野生型更为敏感，猜测其可能参与水稻耐热分子遗传信号通路中。本研究将提高对水稻调控高温信号通路的认知，填补水稻CNGC参与高温响应研究的空白，为进一步为培育耐高温水稻品种提供一定的理论依据和思路。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法6
1.1材料 6
1.2实验方法 6
2结果与分析7
2.1候选基因的获得及突变体的构建7
2.2cngc突变体生长表型测定.9
2.3cngc突变体耐热表型测定10
2.4通过活性氧积累检测分析耐热表型10
2.5通过离子渗透鉴定分析耐热表型11
3讨论... 12
致谢13
参考文献13
水稻CNGC基因突变体的产生及耐热表型的鉴定
引言
引言
作为定植生物，植物无法通过改变自身位置来躲避外界环境的高温胁迫。随着全球变暖，包括极端高温在内的气候变化给作物产量造成了毁灭性损失[1,2]。高温造成植物细胞膜超流态化并破坏其结构[3]，通过影响蛋白质折叠和聚合使其失活[4]，导致细胞失水、新陈代谢紊乱和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生[5]。上述危害会进一步影响植物的光合活性，导致敏感组织尤其是生殖器官坏死，进而影响植物生长、发育和繁殖，最终导致作物产量降低[6]。原核和真核生物进化出一种热激响应(heat shock respones，HSR)来保护、修复或降低高温对细胞大分子物质造成的损害。当HSR 被触发时，植物基因组中有数百个基因存在明显的上调表达现象并积累大量的热激蛋白(heat shock proteins，HSPs)，这些HSPs 中大 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
多数作为分子伴侣，修复HS(heat stress)过程中变性的蛋白质[7]。HSR 在高温胁迫下及时合成HSPs 是植物获得耐热性所必需的，基础和获得性耐热是HSPs和其它代谢物共同积累的复杂生物学过程。HS 还会诱导产生ROS 清除酶，如抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和过氧化氢酶(catalase，CAT)，来增强HSR信号[8, 9]。研究表明，HSPs 基因上调表达是由于热激转录因子(heatshock transcription factors，HSF)被激活并结合到其启动子区域。此外，植物耐热性也受其它信号通路所调控，例如植物激素水杨酸和脱落酸等。近年来，尽管HSR信号通路已被广泛研究，但对于植物是如何感知、转导高温胁迫的信号还有许多问题有待解决。
耐高温胁迫研究的基础即是对耐热表型进行的鉴定。不当的表型鉴定可能会低估植物对于热胁迫响应的复杂度，且实验室所进行的胁迫处理通常比较简略，无法反映出真实条件下的热胁迫[10]。人工气候室和培养箱是创造热胁迫条件较常用的工具，必要时田间试验也可以更好地反映水稻的耐热性。而不同的热胁迫处理方法则可以用以区别植株不同的耐热类型，总共的四种耐热类型分别是基础耐热性（BT）、短期获得性耐热性（SAT）、长期获得性耐热性（LAT）以及适度高温耐热性（TMHT），但长期获得性耐热性（LAT）很少在水稻等作物中被报道。不同的时期进行热胁迫处理得到的结果也不同，一般进行处理的时期有种子、苗期、成熟叶片及花期。用于造成热胁迫的高温研究中4245摄氏度都有使用，处理时间也从数小时到数十小时不等，且处理过后需在正常温度下进行几天的恢复生长，此时得到的表型较为明显和准确。而我国南方的高温也给田间试验创造了良好的条件，这种处理也更加贴近实际，但土地水平的均一性至关重要，以免条件的差异造成的结果的不准确。
水稻是世界上最重要的粮食作物，是全球一半多人口的首要食物来源[11]。迅速的全球气候变暖将在本世纪末严重影响热带和亚热带的粮食产量[12]。育成耐热水稻品种是应对这一挑战最基础的方法[13]。水稻耐高温机制的研究是一项基础而又重要的工作，将给水稻耐高温育种提供理论基础及方法指导。
高温会抑制植物的生长、影响种子萌发、影响光合效率和其他核心代谢过程、影响花粉活力、影响植物呼吸作用、水分的平衡以及蛋白与质膜的稳定性等[10]，这些都可以作为表型鉴定的对象去分析耐热性的强弱。虽然水稻的植株比拟南芥高大，但大部分鉴定和拟南芥相似，因为鉴定的材料一般都是苗期的水稻或是叶片上的一部分，不同的是在水稻中最后产量的高低也是衡量其耐热性的一重要指标，经济产量是作物最重要的性状之一，也是衡量其是否可以用于实际生产中的重要指标。
好的材料是研究的基础，和研究其他性状一样，用EMS，辐射诱变等得到的突变体及TDNA突变体库是用于大规模筛选耐热候选基因的普遍材料。当筛选到耐热或敏热单株后，将其与野生型植株杂交和自交后得到表型分离的群体，利用SSR、SNP等分子标记对突变基因进行定位的方法在水稻中被大规模使用。除了人为诱变外，自然界存在着丰富的水稻种质资源，由于各地气候条件选择的结果，各种质资源的耐热性都有不同，而作为一个数量性状，可以借此将各地的水稻品种的耐热性进行等级划分，然后利用日趋成熟的测序技术对它们的基因组进行测序，并利用全基因组关联分析的技术得到候选位点，再在候选位点的上下游寻找可能的候选基因。利用自然群体做GWAS可以得到一些新的耐热基因和一次性得到多个候选位点，但表型鉴定的准确性对于结果的可靠性影响很大，且由于算法的局限性，此类分析方法也可能漏掉很多关键的耐热位点。
利用全世界丰富的水稻品种资源及人为创造的突变体等材料，研究人员已鉴定得到一些赋予水稻耐热性的关键基因，如从非洲稻的染色体片段置换系中克隆到的OgTT1[14]，从水稻TDNA突变体中鉴定得到的OsER1[15]等。与此同时研究水稻耐热机制的技术方法也在进步和发展，从基本的表型筛选到利用蛋白质组学分析技术[16]进行鉴定。而研究得到的耐热机制涉及的代谢通路也越来越多，现已研究发现活性氧可以促进植物对逆境的耐受性[17]，脱落酸介导的水分控制也影响着植物对于逆境的耐受性[18],调节气孔开闭以应对胁迫的通路也存在着很多条[19],除了上述经典机制之外，小RNA也在调节水稻耐热中起到重要的作用[20]。由于胁迫条件的相似性，耐热的机制与其他胁迫如耐旱机制间存在着偶联，但两者还是有着不同，如有些情况下，轻度高温胁迫会引起耐性品种的气孔开度增加以增加水分蒸腾以保持叶面温度的稳定，而失水则对于受干旱胁迫的植株不利。相比于拟南芥来说，在水稻等作物中研究耐热的遗传基础更加的不方便，而作物中存在的一些耐热机制并不存在与拟南芥等模式植物中[21]，这就给水稻等植物的耐热研究增加了难度。

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