淀粉突变体是研究水稻淀粉代谢途径的优良材料。淀粉约占水稻胚乳干物质总量的80%，胚乳中淀粉的组分与含量以及颗粒结构决定了稻米品质。探索淀粉代谢机制对于提高淀粉类作物产量和质量有着重要意义。水稻突变体W9142具有胚乳粉质的外观表型，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、标记基因型分析等手段，对该材料进行了初定位与精细定位，以期发掘控制淀粉合成运输相关的新基因，为培育水稻新品种提供帮助；同时对突变体表型和生理生化进行分析，初步探讨W9142突变的分子机理，为深入了解AGPase的作用机制奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract.1
Key words..1
引言1
1材料与方法.2
1.1材料种植 2
1.2 实验方法.2
1.2.1 成熟种子直链淀粉、总淀粉和总蛋白质含量的测定.....2
1.2.2 成熟种子胚乳横截面扫描电镜观察2
1.2.3 W9142的图位克隆2
1.2.4 分子标记多态性筛选及定位分析..3
1.2.5 基因预测和测序..4
1.2.6 AGPase相关基因的表达分析4
1.2.7 蛋白Westernblot分析5
1.2.8 AGPase酶活测定5
2 结论和分析5
2.1 突变体的W9142的表型及农艺性状分析.5
2.1.1野生型和W9142的外观、成熟籽粒的粒型和千粒重的比较5
2.1.2野生型和W9142的直链淀粉含量、总淀粉含量以及总蛋白质含量的测定6
2.2 突变体W9142种子中淀粉颗粒结构异常7
2.3基因定位与图位克隆7
2.4 W9142突变体及野生型中的相关基因表达及酶活分析9
3 讨论12
3.1 OsAGPL2单碱基的突变导致不透明胚乳的产生12
3.2突变体W9142的OsAGPL2突变对AGPase其它基因的影响12
致谢..12参考文献..12
水稻粉质突变体W9142突变基因的克隆和初步分析
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实验131 吴碧颖
引言
水稻（Oryza sativa L．）是世界上最重要的粮食作物之一，因为其高产稳产、适应性强的特点而在全世界范围内被广泛种植。据统计，种植水稻的国家己经达到112个，超过水稻总栽培面积的90％集中在亚洲地区。稻米的品质优于其它粮食，是我国半数以上人口的主食。水稻籽粒中的淀粉含量通常占到精米重量的90％左右，因此，淀粉的含量及组成对于水稻的产量和品质至关重要[1]。植物源组织光合作用的最终产物，经过一系列代谢过程后，以淀粉的形式贮藏在库组织中。淀粉作为主要的储能物质，是植物种子生长发育的主要能量来源。研究水稻淀粉合成的遗传、了解淀粉代谢途径的调控，对于改善淀粉品质、培育优质品种具有重要意义[2]。
胚乳内的淀粉分为直链淀粉和支链淀粉两类，直链淀粉是由葡萄糖α1,4糖苷键连接而成的多聚糖，支链淀粉是由葡萄糖经α1,6糖苷键连接而成的多聚糖，两者均在造粉体中合成。淀粉的合成首先是绿色组织通过光合作用合成葡萄糖，然后转化为蔗糖；蔗糖通过维管束运送到籽粒中，蔗糖在尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase1）作用下水解为 UDP葡萄糖和果糖，然后转化为1磷酸葡萄糖，后者在 ADPGase催化下合成腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG），ADPG 在淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（BE）和淀粉去分支酶（DBE）等作用下合成淀粉。淀粉合成、代谢相关基因的突变多数都会引起淀粉含量或结构的改变。目前已经报道的淀粉相关突变体主要包括垩白、皱缩、糯性、粉质等类型[3]。
本研究通过筛选宁粳3号突变库，从中得到了一个粉质突变体W9142。通过图位克隆的方法，发现突变基因编码AGPase的一个大亚基，该基因的同源基因在拟南芥、玉米中也广泛存在[4]。本研究对W9142中基因OsAGPL2进行表达水平检测，探讨了W9142的突变机理，对该突变体的形态学特征和生理生化进行了初步的描述与分析。
1 材料和方法
1.1材料种植
突变体W9142是来源于宁粳3号的突变体。将W9142与籼稻品种Dular杂交、自交，构建F2群体，之后利用F2：3群体进行基因的精细定位和图位克隆。所有群体均种植在江苏省南京市土桥实验站，田间管理同大田生产。种子成熟以后，及时分单株收种，备用。
1.2实验方法
1.2.1 成熟种子直链淀粉、总淀粉和总蛋白质含量的测定
取野生型和突变体W9142成熟籽粒，用JLGJ4.5糙米机（浙江台州粮仪厂）制备糙米，用JNMJ3精米机（浙江台州粮仪厂）制备精米，去除种皮、果皮、糊粉层和胚。用JFS13A粉碎磨（浙江台州粮仪厂）磨碎后，过100目米筛，制备米粉。
直链淀粉含量测定按照农业部标准NY14788进行；总淀粉含量使用 Megazyme总淀粉测定试剂盒测定；总蛋白含量使用FOSS公司Kjeltee 2300型全自动凯氏定氮仪测定。每个样品重复三次，取平均值[4]。
1.2.2 成熟种子胚乳横截面扫描电镜观察
将野生型和突变体W9142成熟种子从中间部分横切制成样品后，在3％的戊二醛溶液中室温浸泡 3h，然后用0.1 mol/L 的磷酸钠溶液（pH=6.8）冲洗3~5次，每次进行15min。接着用2％的四氧化锇溶液在4℃下固定过夜，固定后的样品用0.1mol/L的磷酸钠溶液（pH=6.8）冲洗2~3次，每次15min，然后用70％、80％、95％、100％乙醇溶液逐级脱水，每次5min，再在乙醇－异戊基醋酸（体积比为1∶3）混合液中浸泡1h，取出干燥，最后用金粉包被，在日立S3000N 型扫描电子显微镜下观察（加速电压为10~20KV）[5]。

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