摘要：随着分子生物学的发展，转基因的应用也越来越广泛。但是人们所关注的是外源基因自己在宿主细胞的表达是不是对人类安全，而对外源基因的插入对整个宿主基因组及细胞代谢的影响却少有研究。本课题以能正常产生毒素DON的亚洲禾谷镰孢菌为研究材料，以分子生物学上广泛使用的筛选标记基因潮霉素抗性基因hph作为外源基因随机插入小麦赤霉病菌的基因组中，通过毒素合成基因tri5的定量表达反应hph随机插入突变体的产毒能力，进一步分析外源基因的插入带来的风险。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
1 材料与方法2
1.1材料2
1.1.1供试菌株 2
1.1.2实验常用培养基 2
1.2 方法 2
1.2.1 获得hph随机插入突变体2
1.2.2 GYEP培养基摇培与菌丝的收集3
1.2.3 提取突变体的RNA,并反转成cDNA3
1.2.4 荧光定量PCR定量分析毒素合成基因tri5的表达4
2 结果与分析 5
2.1转化子的筛选5
2.2 转化子验证5
2.3转化子毒素合成基因tri5表达量的变化5
3 讨论6
致谢7
参考文献8
表 1hph随机插入小麦赤霉病菌基因组中tri5表达上下调频率6
潮霉素抗性基因随机插入对小麦赤霉病菌DON毒素合成的影响
引言
引言 小麦赤霉病（Fusarium head blight,简称FHB）的病原菌镰刀菌在自然界中分布广泛,行寄生或腐生生活，其病原菌的无性态为禾谷镰孢菌( Fusarium graminearum Schw )，有性态为玉蜀黍赤霉〔Gibberella zeae (Schew.), Retch〕[1]。它是人类发现的最重要的植物病原菌之一，可以侵染多种经济作物，包括粮食作物，油料作物，药用植物及观赏植物。镰刀菌侵染植物后，会造成植物萎蔫、根腐、穗腐等多种类型的腐烂病，导致作物的严重减产，从
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而造成重大的经济损失[2]。
赤霉病的发生不仅使得小麦的产量受到严重的损失,更重要的是它在降低小麦品质的同时严重的威胁着人和动物的健康。镰刀菌在侵染作物尤其是小麦的过程中会分泌产生多种次生代谢产物镰刀菌毒素,对人和动物的健康危害十分严重。镰孢菌侵染引起的小麦赤霉病病麦中存在两大类真菌毒素：一类为如DON、T2等单族毒素等;另一类为具有雌性激素作用的玉米赤霉烯酮类(zearalenone, ZEN)[3]。镰孢菌产生的单族毒素有60多种，如DON、雪腐镰孢菌烯醇(nivalenol, NIV)和T2。DON和NIV主要由禾谷镰孢产生，T2毒素主要由拟枝孢镰孢(F.sporotrichioides Sherb)产生。单族毒素对所有真核生物均具有一定的生物活性，能抑制所有真核生物的蛋白质合成[4]。残留于病麦中或病麦加工品中的单族毒素会对人、畜等造成严重危害。其中DON又称为致呕毒素(vomitoxin)，人、畜摄入后会产生呕吐、眩晕等急性中毒症状[5]。目前已分离和合成的ZEN衍生物有20余种，其生物学活性主要表现为对动物的类雌性激素作用。ZEN的另一生物活性是可以增加体内的合成代谢，商业上已用作牲畜的生长促进剂。ZEN在粮食和饲料中普遍都可检出，但一般情况下含量不太高。在赤霉病病麦引起人中毒时，均未见到有关人对玉米赤霉烯酮中毒症状的报道。已经证实人类的一些疾病与食用受到单端孢霉烯类毒素（单族毒素）污染的谷物有关，亚洲种主要以脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）为主。 在禾谷镰孢菌的基因组中存在一个影响毒素表达的tri5基因簇，其中tri5基因编码的是单端孢霉二烯合酶，该酶催化合成进入单端孢霉烯烯毒素生物合成途径的第一个前体,它的表达直接影响毒素合成反应并影响毒素合成量[6]。因此，我们通过禾谷镰孢菌的tri5基因的表达分析小麦赤霉病的产毒能力。
随着分子生物学的发展，转基因的应用也越来越广泛。20世纪70年代Bt毒蛋白基因最早应用在抗虫棉上，如今在玉米抗虫上使用也非常普遍[7]。英国科研工作者培育的转基因土豆，可以有效避免土豆受到马铃薯晚疫病的侵害。将胡萝卜素转化酶系统转入大米胚乳中，人们获得了外表金黄，可以帮助人体增加维生素A的吸收的黄金大米。人们希望通过将外源的优良基因导入农作物中得到抗虫、抗病、高产、优质的品种，以满足人们的需求[8]。从以上事例我们发现人们所关注的是外源基因自身在宿主细胞的表达是不是对人类安全，而对外源基因的插入对整个宿主基因组及细胞代谢的影响却少有研究[9]。
因此，我们以分子生物学上广泛使用的筛选标记基因潮霉素抗性基因hph作为外源基因随机插入小麦赤霉病菌的基因组中，通过毒素合成基因tri5的表达反应插入突变体的产毒能力，进一步分析外源基因的插入带来的风险。
1 材料与方法
1材料
1.1.1供试菌株
本研究采用的是能正常产生DON毒素的野生型禾谷镰孢菌2021，由本实验室保存。
1.1.2实验常用培养基
PDA培养基（马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15~20克、纯水1L，高温高压灭菌后常温保存）
GYEP培养基(5%葡萄糖，0.1%酵母粉，0.1%蛋白胨，纯水定容到1L，高温高压灭菌后常温保存。)
绿豆汤培养基（3%绿豆煮到微微破皮后过滤去渣，高温高压灭菌后常温保存。）
2 方法
1．2．1 获得hph随机插入突变体
1.2.1.1分生孢子制备
（1）菌株在PSA上培养23天，取菌落边缘菌碟接种于3%绿豆汤培养液中（10碟/150 mL），25 °C、170 rpm、12 h/12 h光暗交替摇培47天；[10]
（2）23层无菌擦镜纸过滤，收集分生孢子，5000 rpm、离心10 min，弃上清，用灭菌水洗涤2次，1mL灭菌水悬浮分生孢子，置于4 °C保存备用。
1.2.1.2幼殖体制备：
（1）分生孢子悬浮液接种至100 mL的YEPD培养液中，使分生孢子浓度达1×1065×106个/mL，25 °C、175 rpm摇培1214 h（此时幼殖体长度达孢子直径的310倍）；
（2）23层灭菌擦镜纸过滤，0.7 molL1 NaCl溶液冲洗，并用50 mL 0.7 molL1 NaCl溶液重悬幼殖体；2层灭菌擦镜纸过滤，0.7 molL1 NaCl溶液冲洗，50 mL NaCl溶液重悬幼殖体；
（3）重复过滤、冲洗、重悬过程直至幼殖体悬浮液基本无分生孢子（至少两次）；

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