蛋白质的泛素化需要一系列酶的参与，包括泛素激活酶、泛素结合酶和泛素连接酶等。目前，在植物研究中，泛素结合酶研究较少，尤其是泛素结合酶在植物免疫中起到的作用至今尚未详细报道。本课题选取菊花泛素结合酶家族基因进行研究。通过结构域比对，我们鉴定了菊花中泛素结合酶家族基因，并对菊花泛素结合酶家族基因进行基本的生物信息学分析。此外，通过分析菊花接种黑斑病菌的转录组数据，鉴定了菊花中响应黑斑病菌侵染的泛素结合酶。随后，通过PCR克隆、基因测序和序列比对分析，我们从切花菊‘神马’中获得了响应病菌侵染的泛素结合酶基因完整的编码区序列，为后续研究菊花泛素结合酶基因响应病菌侵染的作用机理奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
绪论1
1材料与方法3
1.1菊花CnUQ家族基因鉴定3
1.2菊花CnUQ家族基因系统进化树建3
1.3菊花CnUQ家族基因保守序列、结构域分析3
1.4菊花CnUQ家族基因响应病原菌的侵染表达特性分析
1.5菊花CnUQ家族基因克隆与载体构建3
1.5.1引物设计3
1.5.2PCR反应3
1.5.3琼脂糖凝胶电泳4
1.5.4载体连接4
1.5.5菌落PCR检测阳性克隆 4
2结果与分析5
2.1鉴定菊花CnUQ家族基因 5
2.2菊花CnUQ家族基因系统进化分析6
2.3菊花CnUQ家族基因蛋白结构域预测和分布 7
2.4菊花CnUQ家族基因组织表达特性8
2.5菊花CnUQ家族基因响应病原菌的侵染表达特性9
2.6基因克隆结果及序列分析9
3讨论10
3.1菊花CnUQ家族基因的克隆与表达分析 10
3.2泛素结合酶的特性与功能 10
致谢11
参考文献11
菊花泛素结合酶家族基因功能分析
园艺 帅仕民
引言
泛素蛋白酶体途径是真核细胞中必不可少的，蛋白酶体，它 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
的主要作用是维持细胞功能，保证细胞周期的正常运转，同时有效地抵御外界环境对细胞产生的不利因素，为胚胎的发育提供良好的环境。在泛素化过程中，三种蛋白酶体起到了重要的作用，为维持细胞的稳态和正常功能的运转作出了巨大的贡献。这三种蛋白酶分别是泛素蛋白连接酶、泛素结合酶以及泛素活化酶[1]。
本文针对植物泛素化进行研究，着重讨论了菊花泛素结合酶基因，同时利用实时定量 PCR分析了在生物胁迫条件下该基因的表达变化。众所周知，在蛋白质总数量统计中，大约5%的基因编码属于植物泛素。泛素蛋白连接酶(E3)、泛素结合酶(E2)与泛素活化酶(E1)作为植物蛋白泛素化系统中的三种基因，它们分别发挥着各自的功能和作用[2]。本文主要针对泛素结合酶（E2）进行一定程度的研究。植物基因组的编码序列中，一共含有E2基因及8个E21ike基因，这些基因决定着蛋白粉活化的效率。E21ike基因由于只含有一个UBC结构域，因此没有E2基因的酶活性，我们在此不作考虑。
泛素化过程是细胞内蛋白质降解方式中的一种，它主要是通过多泛素链的泛素化功能将底物蛋白泛素化。这三种酶会进行联合反应，最终将蛋白水解成多肤，这种多肤含有的氨基酸残基个数通常在322个之间，而多聚泛素链在循环酶的作用下会进行分解，形成单个的泛素分子，然后单个的泛素分子会被释放出来，再重新利用，这一整个过程就被称为泛素一蛋白酶体途径的循环。
这三种蛋白酶在实现泛素化时，互相之间相辅相成。在这个过程中，泛素活化酶起到将泛素分子激活，并将已经激活了的泛素分子再与泛素结合酶连接的作用。泛素蛋白连接酶的作用在于结合目标蛋白，同时在泛素结合酶将激活的泛素分子转移到目标蛋白上时起到促进作用。因为泛素蛋白连接酶含有特定的HECT结构域，泛素结合酶也可以将泛素先直接转移到泛素蛋白连接酶上，转移之后，泛素蛋白结合酶暂时充当供体的作用，将泛素与目标蛋白进行结合，由此实现目标蛋白质的泛素化过程；最后，离目标蛋白质被降解还有最重要的一步，就是泛素化蛋白质会被运输至26S蛋白酶体中，只有这样才能达到降解目的。所以，泛素化这一整个过程中，泛素活化酶(E1)起到了激活和连接的作用，而泛素结合酶(E2)则在其中充当了转移和结合泛素分子的一个角色，而泛素蛋白连接酶(E3)的作用主要是提供供体并且结合目标蛋白。三种酶各司其职，发挥着各自不同的作用，在要进行泛素化并降解的目标蛋白质共同承担着不同的作用。
王安邦[3]等研究者对香蕉泛素结合酶基因MaUCE2基因克隆进行了分析，探究了其在多种非生物胁迫处理下的表达特性，为泛素结合酶(E2)在植物逆境胁迫中应用提供理论依据。
科学家通过研究发现龙葵具有极强的干旱适应性，这一特点也让龙葵在研究植物的抗逆机制时成为一个理想的基因库。通过试验研究[4]为SorUBC基因编码区全长编码了295个氨基酸，并对其进行进化树分析剖示。分别探讨了龙葵在干旱环境、盐、碱、高温和低温各种不同情况下的各器官表达特征，利用荧光定量PCR技术进行分析，研究SorUBC基因在不同环境情况下表现的非生物胁迫处理，收集其根部和叶片的表达特征情况，并且测定龙葵叶片在不同情况下的生理反应。
学者文添龙[5]等研究发现，植物对非生物胁迫环境作出及时有效改变是生存本能的一种需要。学者文添龙等推测该基因存在其他的潜在的功能，比如在植物各器官中都存在着多种的泛素结合酶基因。
刘亚玲等[6]研究通过研究野生卵穗苔草泛素结合酶基因片段的克隆与序列，分析发现由于植物本身在生长发育过程中极易受自然条件的影响，因此自然环境发生的一系列自然变化以及一些特殊的情况会对植物的生长造成一定的影响[7]，此时泛素蛋白酶便可以发挥其作用，减少自然环境变化对植物生长的影响，而E2泛素结合酶在泛素化过程中对植物应对不良环境有一定的积极作用。
研究表明，细胞调控机制与蛋白质的泛素修饰有着紧密的联系 ,其中包括I族抗原的进一步加工以及细胞周期转换［8］。蛋白质以很多酶作为桥梁来进行泛素化过程和去泛素化过程，蛋白质降解是所关涉的泛素途径其实偏于保守的存在于多种真核生物中，其中关涉到的的有泛素蛋白连接酶和泛素活化、结合酶的共同作用。在目前已有几十种结合酶被分离出来了，它们有一个共同点就是都含有保守的用于降解的泛素结合结构域(UBC)，并且位于活性位点处，存在一个作用很大的半胱氨酸残基。人的第一个泛素结合酶于1994年被分离和克隆[9]出来，它是从外周血淋巴细胞而来，并且在多种组织中都有存在着植物启动子这个元素，它在植物基因转录过程中充当了举足轻重的调节作用，是重要的一个元件。关于启动子的研究，近几年不同的学者进行过不同方面的分析，包括其结构和功能，通过多种手段，如功能分析、分类和克隆等，对启动子展开了各方面的论述。其中重点总结归纳出存在于植物组织中的启动子的主要分类以及它近期关于它的研究有何进展，同时标示了植物启动子在未来的研究中的核心内容。

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