近年来，我国的水果产量节节攀升，梨作为我国农作物中重要的一份子，无论是种植面积还是出口数量在所有水果中都稳居前三。为了更高效的生产与管理，我们有必要关注梨的抗旱能力。并且全球淡水资源的储量急剧下降，干旱或半干旱地区在我国占据了将近一半的面积，为了节约水资源，我们也应将提高植物的抗旱能力作为重要的研究课题。近些年来，基因工程已成为一种高效快速的育种方法，我们可以将拥有抗旱功能的基因导入植物中，从而获得抗旱能力强的新品种。根据当前研究进展，HSF基因已被发现于各种植物内，在植物抗逆活动的信号途径中扮演重要角色，目前其研究主要集中在其对高温胁迫的响应上，故本研究会从杜梨中将PbrHSF基因分离出来导入模式植物来验证其的抗旱功能，从而为培养抗旱性强的梨的新品种做准备。首先我们采用CTAB法提取出了杜梨的RNA,并合成其cDNA后续采用荧光定量PCR法完PbrHSF基因的克隆，并构建pMV-PbrHSF基因经过连接中间载体以及大肠杆菌感受态的制备等一系列步骤最后将PbrHSF基因转入农杆菌中，做菌液PCR鉴定其为阳性，使用携带PbrHSF基因的大肠杆菌侵染模式植物烟草并将其子一代与野生型做干旱处理观察其表型与气孔开合程度，最终分析得到结果为转基因组抗旱性显著，说明PbrHSF基因具有良好的抗旱性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1.1PbrHSF基因的克隆2
1.1.1材料 2
1.1.2RNA 的提取 3
1.1.3cDNA的合成3
1.1.4 荧光定量 PCR 3
1.2PbrHSF基因的克隆4
1.3连接中间载体(Peasy)4
1.4 转化大肠杆菌感受态 4
1.4.1 大肠杆菌感受态 DH5α 的制备 4
1.4.2大肠杆菌的具体转化方法4
1.5质粒销量提取的方法5
1.6酶切与连接 5
1.7农杆菌的感受态转化 6
1.7.1农杆菌 GV3101 感受态的制备 6
1.7.2转化农杆菌及其鉴定6
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F基因的抗旱功能鉴定6
2.1烟草的遗传转化 6
2.2转基因阳性苗的鉴定7
2.3PbrHSF抗旱功能鉴定 7
3结果分析7
3.1.1气孔开闭程度7
3.1.2叶片失水程度对比7
4.结论8
致谢9
参考文献9
HSF基因的克隆和功能验证
引言
引言
植物基因工程是指，通过人为操纵从其他的生物中提取出外源基因（DNA），在植物体外构建表达载体，将携带外源基因的表达载体导入到目标植物细胞中，并使该外源基因在植物细胞中表达出来。由于目的基因功能已经过前人验证，故可达到定向改良植物的效果[1]。这样的技术可以帮助我们节省大量时间，故多年来基因工程在植物抗病害，抗虫害，抗逆，抗旱耐等方面有了巨大的突破。
现发现HSF基因存在于各种植物内，在植物抗逆活动的信号途径中起着重要的作用[2]。杜梨是一种广泛种植于北方的抗逆性强的品种，由于其耐寒耐寒耐盐等优良性质，故常将该品种作为砧木[3]。本研究旨在从杜梨中克隆出抗旱相关基因，并将该基因转入模式植物烟草中进行功能鉴定，从而为进一步研究其抗旱机理与培养新的抗旱品种打下基础。
1 材料与方法
1.1 PbrHSF基因的克隆
1.1.1 材料
研究材料为植在大学国家梨工程中心苗龄约为30天的杜梨种，从材料中分 离克隆出PbrHSF基因。
1.1.2 RNA 的提取
使用CTAB的方法用于提取RNA，具体方法如下：
实验前的准备：DEPC水处理CTAB的提取液，LiCl（10 mM），NaAc，双蒸水，各种类型的枪头、1.5 ml和2 ml的离心管、冻存管（装上DEPC水和装上70%的乙醇）、研钵和研棒。处理时间超过8 h，高温高压灭菌，干燥备用。不处理：β巯基乙醇、氯仿：异戊醇(24:1)、无水乙醇。
（1）把液氮加入已在液氮中预冷的研钵中，并在研钵中称量0.3 g样品，并快速多次的将样品磨成粉末，在粉末中注意适当加入液态氮研磨三、四次，但次数不宜过多以防止多次冻融将RNA的结构破坏，加入2ml离心管（1 ml CTAB提取液＋β巯基乙醇20–50 μl/ml）中，涡旋被迅速解冻和溶解，最后需要用CTAB的提取液来平整；
（2）样品在65°c的水浴锅中温浴30 min，每5 min就上下颠倒进行一次混匀，在4°C预冷的离心机中使用12000rmp并离心机15 min；用CTAB提取液将上层清液转移到一个新的预冷的2ml离心管内补平。
（3）把等体积的氯仿加入在通风橱中：异戊醇(24:1)，涡旋混合均匀5min，12000
rmp,4°c预冷离心15min；将上层液体转移到新的预冷离心管内（在提取上层液体时注意不要吸到蛋白质层以防止污染）；
（4）将上清洗液转移到全新的已经预冷的1.5ml离心管里；加入2/3体积的LiCl，上下颠倒混合均匀，在20°C中过夜（超过8小时，但也不要太长的时间）；
（5）在4°C环境中,12000rmp离心30min后；加入1ml浓度为70%的乙醇溶液(可现配，取决于两次沉淀的总量，用前需在20°C中进行预冷)，洗去上面的沉淀，充分吸打洗涤（时间约为1 min），4°C预冷，且继续在12000 rmp的空管离心1 min，把上清液吸走，重复以上步骤清洗两次，去掉上清液；在4°c中预冷，继续12000rmp空管离心1min，使用移液枪吸起上面的多余液体；打开离心管的盖子，把离心管放在超净的工作台上吹干；
(6)双蒸水加入适量去RNA的酶溶解(4°C,12000rmp离心机1min)， 4°C时放置几分钟后，立即保存在80°C中作为备用。可以在1 %的琼脂糖凝胶1μl RNA进行电泳检测。
1.1.3 cDNA的合成
在提取叶片RNA之后，用Nanodrop测定RNA的样品浓度，用RNA酶稀释至100 ng/μl。根据全式金公司的反转录试剂盒操作：首先取7 μl 100 ng/μl RNA样品，将其与1 μlAnchored Oligo(dT)18 Primer混合离心，65 °C 孵育5分钟，冰浴2分钟。将10 μl 2×TS Reaction Mix 与1 μl TransScript RT/RI Enzyme 以及1 μlMix gDNA Remover混合后离心，42 ℃孵育15分钟，85 ℃加热5秒[4]。

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