BBX基因家族包含32个成员，在植物的生长和发育过程中作为调控网络的关键蛋白，其作用包括幼苗的光形态建成，光周期途径调节植物开花，避荫反应以及对生物和非生物胁迫的反应等。至今，在拟南芥、棉花、水稻等各类植物中均已有报道，然而在菊花中，对BBX家族蛋白的研究较少，而BBX家族第二类成员 BBX8的研究还未见报道。本研究通过聚合酶链式反应技术（PCR）对目的基因BBX8（CONSTANS-LIKE 10）进行克隆，借助入门系统进行LR重组，进而构建植物表达载体，为后续通过遗传转化来探讨CmBBX8在光周期方面对于菊花花芽分化的分子调控机制奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1实验材料与仪器2
1.1基因克隆 2
1.1.1植物材料 2
1.1.2菌种2
1.1.3引物 酶和生化试剂3
1.1.4仪器3
1.2载体构建3
1.2.1菌种与质粒3
1.2.2实验药品3
1.2.3主要试剂3
1.2.4实验器材3
2.实验方法3
2.1核酸提取3
2.1.1 RNA提取3
2.2反转录4
2.3 PCR扩增及电泳4
2.4 目的基因的回收纯化4
2.5大肠杆菌感受态细胞的制备5
2.6 连接与转化5
2.7质粒提取6
2.8 加酶切位点LA Taq PCR（或加酶切位点高保真PCR）6
2.9载体和目的片段的双酶切 6
2.10 构建入门载体7
2.11目的载体重组 7
3结果7
3.1.1 CmBBX8的克隆7
3.1.2 CmBBX8基因序列比对8
3.2载体构建9
3.2.1入门载体构建9
3.2.1.1入门载体构建原理9
3.2.1.2入门载体测序结果9
3.2.2植物超表达载体构建10
 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
3.2.2.1植物超表达载体构建原理10
3.2.2.2植物超表达载体测序10
3.2.3植物表达干扰载体构建11
3.2.3.1植物表达干扰载体构建原理11
3.2.3.2植物表达干扰载体测序结果12
4生物信息学分析12
4.1序列结构分析12
4.2蛋白二级结构和三级结构分析预测13
4.3 系统进化分析14
4.4蛋白疏水性分析15
4.5基序分析15
5 结论 16
致谢16
参考文献17
CmBBX8基因的克隆与载体构建
引言
引言
菊花（Chrysanthemum morifolium），原产于中国的菊科菊属多年生宿根性草本花卉，世界“四大切花”之一，占全球切花数量的30%[1]。菊花的形态颜色多种多样，具有极高的观赏与经济价值，并且同时菊花还具有极高的食用性和药用性。切花菊在全球市场上的需求量极大，也是我国主要的出口花卉之一。但由于菊花是一种短日照花卉，调控花期需要耗费巨大的人力物力，这也制约了菊花市场的发展。
转录因子是一类用来调控高等植物靶基因的表达的生物因子，Bbox（BBX）蛋白是这样一类锌指转录因子，含有具有一个或两个Bbox基序的Bbox结构域，并且有时还具有CCT结构域[2]。BBX蛋白作为控制生长发育的关键因素，在植物的光信号通路中有重要的调控作用[3]。
图11 植物光周期开花机制模型
红色表示开花抑制基因；橙色和蓝色是受光周期调控的基因；虚线表示基因表达水平的值。
Fig 11.Plant photoperiod flowering mechanism model
Red indicates a flowering suppressor gene; orange and blue are genes regulated by photoperiod; and dotted lines indicate values of gene expression levels.
任丽萍初步研究了在CmBBX在菊花‘优香’中的不同光周期花芽分化过程中的表达模式，结果表明4个CmBBX参与花芽分化过程。采用RTFQ PCR技术，发现菊花CmBBXs在不同光周期花芽分化、低温响应、盐及外源脱落酸胁处理下的表达模式具有组织特异性；一些成员被显著诱导或抑制，推测其可能在成花诱导及胁迫响应中起作用[4]。
BBX8即模式植物拟南芥的同源基因COL10，是本次的研究对象，猜想其通过对光周期的调控，影响CO的表达量来推迟开花时间。
在水稻的研究中，OsCOL10在长短日照下对水稻光周期开花都有着不同的调控模式，并且发现最终不同的两种调控模式都通过抑制开花集成基因Ehd1以及下游成花素基因Hd3a和RFT1的表达来延迟水稻开花[5]。
在对矮牵牛PhBBX8的研究中，PhBBX8受多种非生物逆境胁迫诱导表达且可能在多种信号转导过程中起重要作用。其中，PhBBX8在除干旱胁迫外的其它胁迫下表达量的变化极为显著，初步推断该基因参与了矮牵牛抵抗低温等非生物胁迫的防御反应[6]。
除此之外，在番茄、油菜、烟草等植物中，关于CONSTANS Like基因的相关研究也都各有进展，然而关于BBX8的相关研究无论国内外都相当稀少。本实验利用聚合酶链式反应技术进行CmBBX8基因的克隆，构建菊花转录因子BBX8基因的 入门载体pENTR1ACmBBX8，植物超表达载体pMCD43CmBBX8，植物表达干扰载体RNAiCmBBX8，为后续探讨CmBBX8在光周期方面对于菊花花芽分化的分子调控机制等特性奠定基础。

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/yy/564232.html