休眠是葡萄对外界胁迫和季节性环境变化作出的生物适应，是一个复杂的生命过程，涉及到一系列生理生化反应和许多分子传导，芽休眠是休眠中典型之一。芽休眠受到光照、温度、水分、激素、多胺、糖、抗氧化物酶和钙离子等因素的调控，根据前人研究报道，CBF基因家族能够响应干旱、水涝、低温、铜离子等逆境胁迫。本研究利用本地化BLAST工具，共筛选出十四个物种中推定的205个CBF基因家族成员，计算它们的氨基酸序列长度和CDS数，进行蛋白质序列结构域分析，蛋白质序列比对，系统发育分析，基因分布和基因结构展示，发现氨基酸的长度在100-600之间，CDS数大多1-2个，都含有一个保守的AP2结构域。利用MCScanX和Ka/Ks_Calculator计算共线性和Ka/Ks，得到所有复制基因的Ka/Ks < 1，复制过程是纯化选择。重点分析葡萄CBF基因家族成员葡萄在果实发育时期、芽休眠时期和逆境胁迫下的表达谱。发现在芽休眠时期18个VvCBF基因中，除VIT_00s0341g00080.t01基因外，其余17个VvCBF在芽休眠期间均显著表达，果实发育期5个VvCBF显著表达，16个干旱胁迫下的差异表达基因，在盐、水、铜离子胁迫下分别有8、7、3个差异表达基因。这些研究为进一步研究VvCBF参与芽休眠调控、果实发育以及非生物胁迫提供靶基因。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1植物材料2
1.2序列检索2
1.3识别CBF基因家族成员2
1.4生物信息学分析2
1.5 RNA提取和RTqPCR3
1.6克隆基因3
2结果与分析6
2.1 CBF基因家族成员鉴定6
2.2 CBF的序列特征和基因位置分析6
2.3 CBF的蛋白质序列比对，系统发育树和结构域分析7
2.4 CBF共线性和Ka/Ks分析8
2.5葡萄CBF在芽休眠期间的表达量分析10
2.6葡萄CBF在果实发育阶段的表达量分析11
2.7葡萄CBF在非生物胁迫下的表达量分析1 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
2
2.8葡萄CBF基因的克隆与上传12
3 讨论13
3.1家族鉴定13
3.2序列分析13
3.3表达模式分析13
致谢14
参考文献14
附表115
附图120CBF基因家族的鉴定及在葡萄芽休眠过程中的功能分析
引言
多年生果树的休眠，是果树遇到极度恶劣的外界环境，不利于生长发育时，进行的一种自我保护的措施。当外界环境适宜时，休眠解除，果树恢复生长发育。芽休眠是休眠中的典型之一。
CBF（Crepeat binding factor, CBF）转录因子是AP2/EREBP转录因子家族的一个亚家族，它是植物调节逆境胁迫的重要转录因子之一[1]，能够与启动子中一个5 bp大小的核心片段(CCGAC)相结合，来调控该基因的转录水平[2]。大量的研究表明CBF基因家族成员能够响应干旱[3]、水涝、铜离子[4]、低温[5]等非生物胁迫，还受到上游转录因子的调控[6]。目前，多种植物CBF转录因子参与逆境胁迫的分子机制已经被揭示，包括拟南芥[7]、和葡萄[8]、海岛棉[9]、毛果杨[3]、苹果[10]、胡杨[5]等。在CBF基因家族的研究中，拟南芥较为深入，（Thomashow等2001年）发现拟南芥有6个CBF家族成员，其中CBF1、CBF2、CBF3是紧密连锁，依次分布在拟南芥的4号染色体上。4个CBF基因过表达后均能够激活下游靶基因的表达,并能够提高植物的抗寒能力[11]。拟南芥CBF2基因的负调控作用能够对CBF1 及CBF3 起到适当调节下游基因表达强度，从而适度的调节植物对低温以及相关胁迫的应答[12]。另外，Welling等在苹果上过量表达PpCBFl发现其对短日照很敏感，在短日照条件下PpCBF过量表达诱导进入休眠[10]。胡杨PeuCBFs能快速响应低温、盐、干旱和ABA胁迫, 其中响应低温的程度最高[5]。近来的研究中，葡萄VaCBF1、VaCBF2、VaCBF3、VaCBF4基因均能响应低温胁迫[13]，低温是葡萄芽进入休眠的重要因素之一。为了研究葡萄CBF基因家族成员在葡萄芽休眠中的功能，本研究从十四个物种中筛选出285个推定的CBF基因家族成员进行氨基酸序列比对，结构域分析，系统进化分析，Ka/Ks复制事件和共线性分析。对葡萄的CBF基因，重点分析其在芽休眠、果实发育时期和干旱、水、铜离子、盐胁迫下的表达量数据，构建基因表达谱，为以后的CBF基因在葡萄芽休眠时期的功能研究提供靶基因。
1材料与方法
1.1植物材料
材料采集于江苏省江苏农业博览园的温室中（N32°041.99，E119°157.11）三年生‘白罗莎里奥’葡萄。按照葡萄芽不同的生长位置，将目标材料分为基部（第3、4、5芽）、中部（第8、9、10芽）、顶部（第14、15、16芽）三组，在2017年11月至2018年4月，每个月20号对每组样品采集30个芽，取下后将样品放在液氮中冷冻，然后放置在80摄氏度保存，以待进一步分析。
1.2序列检索
根据植物是否进行芽休眠，将14种植物分成两组：芽休眠组（葡萄，Vitis vinifera;猕猴桃，Actinidia chinensis;柑橘，Citrus sinensis;苹果，Malus domestica;毛果杨，Populus trichocarpa;桃，Prunus persica;梨，Pyrus bretschneideri)和芽非休眠组（香蕉，Musa acuminate;菠萝，Ananas comosus;拟南芥，Arabidopsis thaliana;番木瓜，Carica papaya;草莓，Fragaria vesca;水稻，Oryza sativa;番茄，Solanum lycopersicum)
分别从在线数据库下载14个物种的基因组，mRNA和蛋白质注释文件。从柑橘数据库（V2, http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）中下载Citrus sinensis数据集，从猕猴桃基因组数据库（V1, http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi）下载Actinidia chinensis数据集。 从梨Pear Genome Project档案（V1，http：//peargenome.njau.edu.cn）中获取Pyrus bretschneideri数据集。从Ensembl Plants数据库（http://plants.ensembl.org）分别下载拟南芥Arabidopsis thaliana（TAIR10），香蕉Musa acuminate（MA1），桃Prunus persica（Prupe1.0），葡萄Vitis vinifera和番茄Solanum lycopersicum（SL2.50）多个数据集。从JGI档案馆（https://genome.jgi.doe.gov/portal/）分别下载 菠萝Ananas comosus（V3），番木瓜Carica papaya（ASGPBv0.4），草莓Fragaria vesca（V1.1），苹果Malus domestica（V1.0），水稻Oryza sativa（v7.0）和毛果杨Populus trichocarpa（V3.1）多个数据集。

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