本实验以长春密刺幼叶为实验材料，用CTAB法提取长春密刺基因组DNA，用 PCR 技术扩增了黄瓜CML25基因的启动子序列，构建了重组克隆载体Y∷CML25 promoter∷G∷PMD19-T，并通过 PCR 扩增对阳性克隆进行鉴定。克隆获得CML25基因启动子序列 2979bp，该启动子序列除含有必需的起始转录位点、TATA-box、CTTA-box 外还包含多个顺式作用元件，如光应答元件、赤霉素应答元件、茉莉酸甲酯调控元件等。同时，构建了该启动子植物表达载体Y∷CML25 promoter∷G∷PLP35s，通过 PCR 扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定，为CML25基因启动子的功能研究奠定基础，将为进一步研究该基因的表达调控及其功能分析提供参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与仪器3
1.1菌株和质粒 3
1.2植物材料 3
1.3酶与化学试剂3
1.4引物3
1.5常用抗生素的配置3
1.6培养液及缓冲液配制3
1.7主要仪器 4
2 实验方法4
2.1黄瓜基因组DNA的提取7
2.2启动子片段的克隆7
2.3启动子片段的回收7
2.4克隆载体的构建7
2.5表达载体的构建13
2.6 CML25启动子的序列分析14
3 结果与分析 14
3.1黄瓜长春密刺基因组DNA的提取14
3.2黄瓜CML25启动子片段的克隆14
3.3克隆载体的构建15
3.4表达载体的构建16
3.5黄瓜CML25启动子的序列分析18
4 讨论 20
致谢21
参考文献21
黄瓜钙调素类似蛋白编码基因CML25启动子的功能研究
引言
钙调素类似蛋白(Calmodulin Like Protein; CML)是目前近年新发现的一类恒物细胞所特有的Ca2+响应蛋白家族,对其功能 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
的研究发现它们在植物对环境的胁迫响应中起着非常重要的作用,鉴于其重要性,也受到了越来越多的关注。在目前的研究中，根据基因序列推测，发现在拟南芥和水稻中分别有50和26个基因[1，2]。它们具有进化上保守的Ca2+结合区域EF手型结构,在结合Ca2+后蛋白构象发生改变,从而调控下游祀蛋白的活性。这类蛋白属于传递型感受器。
基因的功能往往与其表达模式息息相关。CMLs基因的表达受到多种因素的调控包括生物和非生物胁迫、激素和化学处理[3]。同时,在植株正常生长发育中,CMLs的表达也是受到严格调控的。目前，植物中CaM、CBL及CDPK家族中的多个成员己经被证明在植物生长发育、植物的自交不亲和、花粉萌发及花粉管生长、生物及非生物逆境胁迫响应、植物激素响应和离子通道活性调控中都有非常重要的作用[4,5,6]。CMLs的功能研究起步较晚,但也取得了一定的进展，有研究表明CML 参与了花粉萌发及花粉管生长、响应胁迫等方面[7,8]。如Zhou等[9]在花粉萌发和花粉管生长系统中, 分析了在花粉中特异表达的9个基因在烟草中过量表达所引起的表型,并用花粉特异的强启动子Lat52,融合GFP标签瞬时转化烟草,观察在花粉管中的亚细胞定位, 分别是CML2、CML6、CMLI5、CML17、CML25、CML26、CML28、CML29、CML32和CML42。结果发现这9个基因都是定位在细胞质中,是细胞远信号转导系统的组成部分。同时有研究表明植物CML通过调节钙离子浓度从而参与调节植物细胞的形态与分裂[10]， 基于黄瓜单性结实转录组学研究的基础上[11]，已筛选并成功克隆了CML25like 基因，验证其功能与黄瓜坐果有关,或参与果实发育与果实膨大，并可能参与了激素诱导的单性结实过程[12]。
植物启动子在转录水平上发挥着重要的调控作用，对其功能进行研究不仅可以反映相应基因的表达模式，还能为利用植物基因工程手段实现基因的高效特异性表达提供有效途径。转录水平的调控在植物基因调控中发挥着重要作用，涉及多种顺式作用元件和反式作用因子。启动子（Promoter）是一类与启动基因表达相关的顺式作用元件，通过与特定的转录因子结合，控制基因转录的起始与表达。基因的表达可受转录、翻译等不同水平上的调控，因此，启动子作为转录水平上重要的调控元件，在基因工程领域开发和利用高效特异的启动子具有重要的研究意义和应用价值。
目前尚未有关于黄瓜CML25基因功能的相关系统研究，故本实验在前人实验的基础上，对CML25启动子进行研究，利用PCR技术克隆CML25基因启动子，构建PLP35s表达载体，并进行启动子序列分析，为进一步研究CML25基因的表达调控及启动子功能分析奠定基础。
1 材料与仪器
1．1 菌株和质粒
质粒载体:含抗Amp基因质粒PMD19T购自Takara公司;感受态大肠杆菌DH5α购自宝日医生物技术(北京)有限公司；PLP35s载体由本实验室保存。
1．2 植物材料
黄瓜长春密刺(CMCC)由本实验室保存。
1．3 酶与化学试剂
常用Fast Digest快速限制性内切酶SalⅠ 、BamhⅠ、EcorⅠ、HindⅢ购自Thermo Scientific公司；高保真 DNA 聚合酶、2××Taq DNA 聚合酶和T4 DNA 连接酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自Omaga生物技术公司；Kanamycin（Kan），Ampicillin（Amp），Rifampicin（Rif），tetracyline(tenta)等化学试剂购自南京寿德生物科技有限公司。
1．4 引物
PCR 扩增引物由南京擎科生物科技有限公司合成，引物序列如下

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