采用蛭石盆栽法，对T6代转StP5CS基因菜用大豆株系进行耐旱性测定，主要研究在干旱条件下StP5CS基因过表达对菜用大豆共生固氮效果的影响。实验结果表明干旱胁迫后，T6代转基因植株生理生长和根瘤发育均显著优于野生植株；T6代转基因植株的脯氨酸含量显著高于野生型植株，而丙二醛含量显著低于野生型株系，即转基因植株细胞膜过氧化程度降低，耐旱性有一定的提高。此外，荧光定量分析可以表明，干旱条件下，与谷氨酰胺合成酶相关的基因GmGS1β，与结瘤基因GmENOD40，豆血红蛋白基因GmLba表达水平在转基因植株中显著高于野生型植株，根瘤豆血红蛋白含量和谷氨酰胺合成酶活性也相应的高于野生型。以上结果表明，StP5CS基因过表达增强了菜用大豆在干旱胁迫条件下的共生固氮效果。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 实验材料2
1.2 实验方法2
1.3 测定项目与方法2
2 结果与分析3
2.1 植株生长指标比较3
2.2 植株谷氨酰胺合成酶活性及豆血红蛋白含量4
2.3 转基因和WT植株结瘤及固氮相关基因表达量的比较5
2.4 植株脯氨酸及丙二醛含量6
3 讨论7
致 谢8
参考文献 8
转StP5CS基因菜用大豆在干旱胁迫下共生固氮效果的研究
引言
我国是大豆的原产地，有千年发展史，而菜用大豆是还未完全成熟的大豆，鼓粒饱满，荚色、籽色翠绿，其富含游离的氨基酸维生素，适应人体肠胃易于吸收，能丰富人体蛋白质来源改善营养状况[1]。菜豆因其独特风味和高营养价值赢得国内外消费者喜爱，我国也成为菜豆的最大生产国出口国，其主要种植地为长江中下游地区和东南沿海地区，速冻毛豆出口量约为世界出口总量一半，且呈现年年递增的趋势，种植面积也在逐年扩大[2]。
生物固氮作为一种与化学固氮完全不同的，一种环保的可持续的氮素提供途径，不影响土壤生产维持农业生产环境保障农作物产业安全[3]。相对于高温高压的工业合成氮素，常温常压下的生物固氮有着更重 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
要的意义。 目前生物固氮有几种主要体系，其中豆科植物的根瘤菌共生固氮体系是最为高效廉价的一个体系[4]。根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，与相应的豆科植物及少数非豆科植物根系共生，能将空气中的分子态氮还原为植物可利用的氨，同时根瘤菌从豆科植物获得其生长繁殖所需的能量和营养物质[5]。
植物耐旱性有多种生物学机理，包括气孔行为、渗透调节、抗氧化防御系统和脱落酸作用等，其中渗透调节通过积累溶质使得细胞膨压稳定，主要累积物为脯氨酸、甜菜碱、多元醇等尤其以积累脯氨酸为主[6]。现在，转基因大豆研究日益兴起，了解到美国孟山都公司将EPSPS基因转入大豆，培育出“农达”转基因大豆并大面积产业化后[7]，为了增强菜用大豆耐盐性，本实验室成功的从野生茄子中分离出了一种新型的StP5CS基因，该基因编码了脯氨酸生物合成中的一种关键限速酶，利用农杆菌介导转化法成功将其转化到菜用大豆品种NY1001中。在2个T3转基因纯合株系(编码为Z13, Z27)的菜用大豆中，StP5CS的过表达确实增加了脯氨酸的积累和植株的耐盐性［8］。然而，在干旱条件下，StP5CS基因的过表达与结瘤和固氮效果之间是否有关系并未研究。本研究以实验室前期获得的稳定遗传的转StP5CS基因的两个株系为实验材料［8］，研究了StP5CS基因在菜用大豆中过量表达对整个植株生理、农艺性状及结瘤固氮的影响，为后续分子育种和转基因大豆产业化奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
T6代转StP5CS基因菜用大豆纯合株系（以菜用大豆‘NY1001’为转化受体品种）。2份转基因材料编号为Z13和Z17；对照组为非转基因菜用大豆品种‘NY1001’，编号为WT.
1．2 实验方法
1．2．1 植株培养 蛭石栽培，于大学防虫温室内。将实验室保存的日本慢生根瘤菌在YMA培养基上培养（平板划线法），至于培养箱中，28℃培养72 h后，用无菌水轻柔冲洗根瘤菌体，装入无菌锥形瓶中制成根瘤菌液（光密度 ＞ 0.2）。挑选状态相同、籽粒饱满、无损伤的菜用大豆种子，70％乙醇灭菌，无菌水冲洗7～8次后，浸种2 h，转移到培养皿中，置于恒温培养箱中，25℃避光催芽。待主根长到3～4 cm 时用制好的菌液浸染，浸染后幼苗立即移栽至装有灭菌蛭石塑料箱中（32×22×12 cm），每箱5株，随机置于温室中培养，环境条件如下：昼夜温度28/20℃；光周期：16 h光照/8 h黑暗；光照强度：600800 μmom2s1；相对湿度7080%。
1．2．2 试验设计 预实验测定干旱胁迫条件下土壤含水量为18%，干旱处理之前按照适宜水分水平定期对植物浇灌无氮营养液，待植物长到两叶一心时开始进行干旱处理。干旱胁迫期间，每天下午5点用土壤水分测定仪监控土壤含水量，并用量筒定量补充水分以控制土壤含水量。盆栽植株分为3组，第一组用于qRTPCR分析，干旱处理3周后取样根瘤，每次取样三个生物学重复，液氮速冻后保存于80 ℃用于RNA的提取。第二组用于生理生化指标的测定，干旱处理3周后取样，每次取样五个生物学重复。第三组在干旱处理3周后解除胁迫对植株进行充分灌水，用于结荚测定单株种子重量和种子粒数。
1．3 测定项目与方法
1．3．1 转基因菜用大豆鉴定 菜用大豆生长20 d后，提取大豆幼叶DNA（天根公司），20℃保存备用。用StP5CS引物(5TGATATCTCGGCTGGCTCTAAAGG3 和5GTTCCACAATCAGGTCATTAAGAC3)，利用PCR技术确定StP5CS基因表达，从而鉴定转基因植株。PCR引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。PCR扩增反应体系10 μL：Premix Taq酶5 μL（TaKaRa），10 μmol/L上下游引物各1 μL，10 ngμL1 DNA 0.5 μLddH2O 1 μL。PCR反应热循环程序为：94℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50 ℃复性30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min，最后4℃保存。特异性引物扩增产物用1.0 % 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色后，在凝胶成像系统拍照记录。

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