液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX在植物耐盐中发挥着极其重要的作用，可将细胞质中的Na+转运至液泡中，从而降低细胞质渗透压，维持离子平衡及酸碱平衡。本论文研究课题以萝卜高代自交系‘NAU-XBC’为材料，分离克隆RsNHX1和RsNHX2的cDNA序列，利用生物信息学软件进行序列同源性和系统进化分析。结果表明，NHX1及NHX2蛋白的氨基端序列之间相对保守，不同物种间存在多个明显的保守结构域，通过系统进化树分析，显示萝卜NHX1蛋白与白菜NHX1蛋白同源性最高，萝卜NHX2蛋白与油菜NHX2蛋白同源性最高。利用RT-qPCR技术分析RsNHX1和RsNHX2在盐胁迫不同浓度、不同时间处理下的时空表达特征。构建RsNHX1和RsNHX2过表达载体，通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥，运用分子鉴定和表型鉴定，在拟南芥中初步验证了萝卜NHX1和NHX2的生物功能。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1供试材料 2
1.1.1植物材料2
1.1.2菌种与载体2
1.2试验方法 2
1.2.1试验材料培养2
1.2.2基因克隆引物设计与合成3
1.2.3 DNA提取3
1.2.4总RNA提取及cDNA合成3
1.2.5基因克隆3
1.2.6序列同源性和系统进化分析3
1.2.7 RsNHX1与RsNHX2过表达载体构建3
1.2.8 RTqPCR4
2结果与分析4
2.1基因NHXs序列特征4
2.1.1萝卜NHXs序列拼接及克隆引物设计4
2.1.2 RsNHX1和RsNHX2基因cDNA克隆和特征分析5
2.1.3氨基酸序列同源性及系统进化树分析6
2.2 RsNHX1与RsNHX2转基因拟南芥功能验证7
2.2.1 RsNHX1与RsNHX2过表达载体构建的引物设计与合成7
2.2.2 RsNHX1与RsNHX2过表达载体构建7
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2.2.3农杆菌工程菌鉴定7
2.2.4 RsNHX1与RsNHX2转基因拟南芥功能验证8
2.3 萝卜 RsNHX1与RsNHX2基因表达特性分析9
3讨论 10
3.1 RsNHX1与RsNHX2的生物学功能10
3.2 萝卜 RsNHX1与RsNHX2基因表达特性分析11
致谢11
参考文献11
萝卜耐盐性关键基因RsNHXs的分离克隆与表达特性分析
引言
土壤盐渍化是危害农作物产量和品质主要非生物因素之一[1]，土壤中高浓度的盐分会造成细胞内渗透胁迫、离子毒害、氧化胁迫、代谢紊乱，从而造成农作物的减产甚至死亡。据不完全统计，截止到2005年，全世界盐碱地面积为9.54亿公顷，其中，中国为9913万公顷[2]。预计到2050年，全世界的耕地面积盐碱化程度将达到50%[3]，随着人口快速增长，粮食增产相对缓慢，对盐碱地的改造收效甚微，使得研究方向更多地转向植物的耐盐机理，以及耐盐品种的选育。一般认为盐胁迫对植物影响主要是由于Na+毒害，Na+与Ca2+、K+存在拮抗作用，当胞内Na+过多时，会取代质膜上Ca2+，影响膜渗透性、破坏细胞结构，导致K+外渗，高浓度的Na+与K+竞争结合位点,也会降低了植物对 K+ 的吸收，K+作为多种酶的活性激活剂，而Na+离子无法激活这些酶的活性[4]，当胞内浓度范围超过酶活性范围时，将影响细胞内酶的正常代谢。为应对盐胁迫，植物漫长的自然选择进化过程发展到如今，可以通过改变自身结构和外部形态，形成了耐盐生理调节机制增加泌盐、限制吸收、Na+外排出细胞或者隔离到液泡中，以降低细胞质中的Na+含量提高耐盐性。植物细胞在Na+外排和Na+区隔的过程中，均有Na+/H+逆转运蛋白的参与[57]，外排主要通过质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1进行，定位于植物的叶和根的质膜上,而 NHX基因被报道可以将细胞质中Na+区隔在液泡中。液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白活性最早发现于甜菜[8]，而第一个克隆出的NHX型转运体基因是在1999年从拟南芥根中检测到并命名为AtNHX1[9]，这组转运体用H+ATPase质子驱动力运输 Na+和K+，以此维持植株耐盐性。NHX基因已被报道的功能主要有：调节植物盐分吸收，提高植物耐盐性；维护细胞内酸碱度，协调胞内物质运输；增加植株生物产量等。
萝卜（Raphanus sativus L.）是一种主要以肉质根为食用器官的重要根菜类作物，营养价值与食用价值较高，是我国第二大蔬菜，在民间有“小人参”的美称[10]，在我国蔬菜生产和周年供应中占有重要地位。我国民间长期流传“萝卜进城，药铺关门”、“十月萝卜赛人参”、“冬吃萝卜夏吃姜，不要医生开药方”等民谚[11]。萝卜肉质根极容易受到不同程度盐害影响，因此，如何创制高耐盐新种质，培育耐盐萝卜新品种，成为当前蔬菜遗传育种领域的一项重要课题。目前，在藻类和酵母的质膜，拟南芥、水稻、棉花、海马齿苋等植物中的液泡膜上均发现了Na+/H+逆向转运蛋白，它们在植物耐盐调控中发挥重要作用，萝卜中Na+/H+逆向转运蛋白基因目前却尚未见报道。有鉴于此，为阐明萝卜耐盐性状关键基因NHXs分子特征与时空表达特性，本研究从萝卜高代自交系‘NAUXBC’中分离克隆Na+/H+逆向转运蛋白基因RsNHX1和RsNHX2的cDNA，分析其在盐胁迫不同浓度、不同时间处理下的时空表达特征，并构建过表达载体转化拟南芥，在拟南芥中初步验证其生物功能，以期为解析萝卜盐胁迫响调控网络与耐盐性的分子机制、耐盐性状遗传改良与种质创新提供重要理论基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 植物材料
高代自交系‘NAUXBC’萝卜种子由大学萝卜课题组提供，供试拟南芥为哥伦比亚野生型拟南芥（Clo0）。
1.1.2 菌种与载体
本研究所用菌株为实验室80℃冰箱收藏的大肠杆菌感受态DH5α和农杆菌菌株EHA105，质粒载体为pMD18T vector(Takara,Dalian)，表达载体为pCAMBIA2301。
1.2 试验方法
1.2.1 试验材料培养
挑选色泽光亮种子饱满的‘NAUXBC’品系种子经5%次氯酸钠溶液消毒后，用蒸馏水清洗、浸种后，于25℃黑暗条件催芽，移栽到装有灭菌基质的穴盘中，置入人工气候箱培养至长出45片真叶，挑选长势一致的幼苗移入1/2 Hoagland营养液中水培一周，每34天更换一次Hoagland营养液。将幼苗移入含不同浓度（（0, 100, 150, 200和250 mM∙L1）NaCl的营养液中进行盐胁迫处理,收取植株在不同时间（0，3，6，12，24，48和96h）的组织样品。拟南芥种子经4℃同步化处理2天后，播于1/2 MS培养基中培养两周，移植于装有灭菌基质的穴盘中（25℃/22℃，16h/8h），待其开花后备用。

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