REV基因为HD-Zip III亚家族重要基因，对植物侧生分生组织活性、器官正常发育、叶极性和适应性发育以及茎中维管系统分化具有重要调控作用，然而目前尚未见有关该基因在菊花中调控表达特性的报道。本研究从菊花中克隆CmREV基因，通过表达特性等分析，发现克隆了CmREV基因，其最大开放阅读框（ORF）2529bp。经分析可知，CmREV与莴苣LsREV同源性高，与拟南芥AtREV同源性较高；CmREV基因定位于细胞核中且不具有转录激活功能；CmREV与CmJAZ3蛋白互作；由表达模式分析可知，CmREV基因在茎中表达量最高，其次是根，在叶中表达量最低，且CmREV积极响应茉莉酸（JA）处理。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2 CmREV基因克隆、序列分析及系统进化树构建 2
1.2.1菊花‘神马’CmREV基因克隆2
1.2.2 CmREV基因序列分析3
1.2.3系统进化树构建3
1.3 CmREV亚细胞定位、转录激活及与CmJAZ3蛋白互作分析3
1.3.1亚细胞定位分析3
1.3.2转录激活活性分析5
1.3.3 CmREV与CmJAZ3蛋白互作分析5
1.4表达特性分析5
1.4.1组织特异性取样5
1.4.2茉莉酸（JA）诱导处理5
1.5数据统计分析5
2结果与分析5
2.1 CmREV转录因子克隆与序列分析 5
2.2 CmREV亚细胞定位特性与转录激活活性7
2.3 CmREV与CmJAZ3蛋白互作8
2.4 CmREV表达特性分析8
2.4.1 不同组织器官中CmREV的表达分析8
2.4.2 CmREV对茉莉酸（JA）激素处理的响应9
3讨论 9
3.1 CmREV与菊花生长发育功能特性研究9
3.2 CmREV与菊花抗性研究9
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br /> 参考文献10
菊花CmREV基因的克隆及表达特性研究
引言
菊花（Chrysanthemum morifolium）是菊科、菊属的多年生草本植物，在中国有着悠长的栽植历史，是中国十大传统名花、花中四君子和世界四大切花之一，不仅具有极高的观赏价值，还被广泛用作食品补充剂或药草茶，食用和药用价值也颇高。
microRNA(miRNA)是一种长度很短的单链RNA，由2024bp组成，能够与靶mRNAs碱基配对从而介导转录后调节，其中miR165/166基因及其靶标基因HDZip III可参与调控植物生长和发育的许多方面[1]。REV基因为HDZip III亚家族的重要成员基因，是miR165/166的靶基因之一[2]。大量研究表明，REV基因能够调控拟南芥侧生分生组织活性、器官正常发育、叶极性和适应性发育以及茎中维管系统分化。在拟南芥中，REV是启动叶腋发育的侧生分生组织（LSMs）和SAM侧翼形成的花序分生组织（FMs）必要的基因[3]，且REV可能在几个已知分生组织调节因子的上游（WUS）和相同途径（STM）中起作用[4]。Paz Merelo等人通过对HDZip III的转录因子REV，PHV和PHB的异位表达发现了调控叶极性建立的一对拮抗转录因子HDZip III和KANADI，REV在侧生器官的近轴区域表达，而KAN1参与远轴端分化。在拟南芥中，REV调控适应性发育主要体现在两方面：生长素介导的生长促进和光介导的生长反应。Paz Merelo等人通过对hdzipIII和kanadi功能缺失/获得突变体分析发现REV/KAN1模式不仅影响生长素的形成，还对生长素的转运及其下游信号起作用[5]。另外，该基因也在拟南芥叶片的遮阴响应中起作用[6,7]。Ronny Brandt等人通过用染色质免疫沉淀/DNA测序（ChlPSeq）的方法，发现REV是一种结合蛋白，其涉及调节基本构型的基因表达和控制参与适应性发育过程 [8]。从rev/ifl1突变体分析发现HDZip III转录因子参与次生细胞壁的生物合成，REV的无效突变导致茎中纤维分化障碍。因此，REV通常作为纤维分化或次生细胞壁形成的正调控因子[9]。
植物的适应、生长和发育依赖于许多环境信号和内源信号的整合，这些信号共同决定植物的整体表型可塑性。植物信号分子，也称为植物激素，对于这一过程至关重要。这些分子在低浓度下通过多方面复杂的信号网络起作用从而实现植物健康和发展。茉莉酸（JA）是一种新发展的植物生长调节物质 [10]，已有研究表明，JA不仅在植物生长发育（种子萌发、花发育、花粉育性、光合特性和酶活性等）中起作用，还能帮助植物抵抗逆境胁迫（干旱、盐胁迫、高温、虫伤、病原菌侵染、机械损伤等）[1114]。
综上，虽然REV基因的功能研究在拟南芥等植物中已取得一定进展，然而有关该基因调控菊花的表达特性研究在国内外尚未见报道。
为此，本研究从菊花中克隆得到CmREV基因，对其进行序列分析、氨基酸同源多序列比对和系统进化树分析；并进行亚细胞定位特性、转录激活活性及与互作蛋白CmJAZ3互作分析；及其对茉莉酸（JA）激素处理的响应表达特性进行分析，从而为进一步功能鉴定奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
（1）实验所用的菊花材料为大学园艺学院“中国菊花种质资源保存中心”品种‘神马’。
（2）所有实验试剂来自Sigma公司；工具酶类来自两个公司：Takara和Invitrogen。
1．2 CmREV基因克隆、序列分析及系统进化树构建
依据菊花的表达图谱完成序列拼接，从中选择含REV相关基因的片段，使用Primer Premier 5.0软件设计ORF引物。
1．2．1 菊花‘神马’CmREV基因克隆
RNA提取步骤如下：
A.组织样品的研磨：称量0.15g左右的组织样品转移到研钵内，加入少量液氮并研磨，待组织逐渐变软时再加入少许液氮，直到其被研磨成粉末状为止；将1mL Trizol加入研钵中（注：研钵中的植物组织要完全浸没在试剂中，否则影响匀浆效果）。
B.组织裂解及人工振荡混匀：匀浆后转入2mL离心管，37℃静置45min，使其完全裂解；4℃，12000 r/min，离心5min后获得上清液；移入1.5mL离心管中，加入200μL氯仿后充分摇匀，直至溶液呈现乳白状，在室温下放置15min。

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