菊花(Chrysanthemum morifolium)属于菊科多年生草本植物，为世界四大鲜切花之一，本文以菊花‘优香’为研究对象，从菊花‘优香’的植株中提取总RNA后反转录得到cDNA，克隆茉莉酸信号路径途径的重要调控因子JAZ8，通过PCR扩增得到CmJAZ8片段，琼脂糖凝胶电泳，回收CmJAZ8并构建pENTR1A-CmJAZ8入门载体，进而重组到pMDC43植物表达载体上，热激转化DH5α。得到阳性克隆并测序正确后转化农杆菌感受态，通过农杆菌介导的叶盘法转入菊花材料‘优香’中，用DNAStar推导氨基酸序列。生物信息学分析表明CmJAZ8的ORF长417 bp，编码138个氨基酸，二级结构中α螺旋占26.09%、延伸链占13.04%、4.35%的氨基酸残基为β转角有6个；随机卷曲占56.52%。进化树分析发现与多数物种中的JAZ亲缘关系较远，可能存在物种特异性。本研究结果为探索该基因利用奠定基础，也为研究JAZ蛋白功能、阐明茉莉酸多样性功能提供了科学依据和技术基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1实验材料 3
1.1.1植物材料 3
1.1.2实验试剂 3
1.1.3仪器设备 3
1.2实验方法 3
1.2.1总RNA提取的准备 3
1.2.2引物设计 3
1.2.3菊花总RNA提取 3
1.2.4去基因组DNA及第一链cDNA合成 4
1.2.5菊花CmJAZ8基因片段的克隆 4
1.2.6目的片段琼脂糖凝胶回收纯化 5
1.2.7目的片段连接转化 5
1.2.8构建表达载体 6
1.2.9转化农杆菌感受态 7
2 结果与分析 8
2.1总RNA的提取结果 8
2.1.1总RNA的电泳结果分析 8
2.1.2 RNA浓度检测 8
2.2菊花CmJAZ8基因片段的克隆 8
2.2.1目的片段的PCR扩增 8 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 

2.2.2阳性克隆的鉴定 9
2.2.3目的基因的序列分析 9
2.3基因片段的生物信息学分析 9
2.3.1菊花CmJAZ8基因的序列分析 9
2.3.2菊花CmJAZ8基因的二级结构分析 9
2.3.3蛋白的三级结构分析 10
2.4表达载体构建 10
3 讨论 11
致谢 11
参考文献 12
菊花CmJAZ8基因的克隆和载体构建
引言
作为我国的十大传统名花与世界四大切花之一，菊花(C. morifolium)不仅可用作观赏，甚至还具有食用性、茶用性、药用性等价值。目前，通过光周期可调节菊花花期，从而进行周年生产，以常年供应市场。短日照花卉是菊花的特点，因此，如若要为周年生产而采取春、夏季遮光及冬季补光等花期调控措施，将会造成大量人力、物力以及财力的浪费，从而限制了菊花产业的进一步发展。关于在植物的茉莉酸信号调控途径中的重要的负调控因子——JAZ（Jasmonate ZIMdomain）蛋白，已有相关人士在不同的植物中进行过分离和克隆，并对JAZ家族基因进行了研究，如长日照植物模式植物拟南芥和短日照植物水稻等。亦有文章通过转基因证明JAZ家族基因的表达可延迟植物花期[1]和降低植株抗虫性[2]。Thines等人对拟南芥中OPR缺失突变OPR3基因opr3的孢子进行茉莉酸处理，发现与对照相比，0.5小时后有31个基因显着表达，其中8个基因功能未知，8个基因中，7个包含了28个氨基酸的ZIM结构域，2个小时后，另一个编码ZIM结构域蛋白的基因显着表达。他们将这些基因定义为JASMONATE ZIMDOMAIN（JAZ）基因。JA处理后，花蕊中JAZ的表达水平在被茉莉酸处理后不仅增加了6到40倍，而且拟南芥种子在用茉莉酸进行处理后萌发了7天。这八个基因的表达水平增加了8到60倍[3]。Shikata等人检测了这些含有ZIM结构域的基因的表达后发现，这些基因只出现在植物中，属于植物特异性GATA型转录因子。此后，又有四个其他ZIM蛋白基因被发现。与先前鉴定的八种蛋白质构成JAZ蛋白质家族，这12种蛋白质具有不同程度抑制JA响应基因的能力。
目前关于JAZ 蛋白的主要研究集中在在分析其结构域的功能、通过研究COI1JAZ相互作用系统来研究茉莉酸的活性形式和受体性质等方面。除JAZ1、JAZ3 与JAZ10之外，对拟南芥的其它JAZ 蛋白还了解得很少。此外还有些有待解决的问题，例如JAZ 蛋白是以同聚肽还是异聚肽的形式存在并发挥作用；还有关于，除了MYC2 蛋白以外，JAZ 蛋白的靶蛋白是否存在其它类型转录因子等。如若这方面的研究存在突破，那么阐明茉莉酸多种生理功能的分子机制指日可待。植物激素茉莉酸酯（JA）在调节植物对昆虫和病原微生物的防御反应中起着重要作用，也是植物生长发育的重要调节因子[4]。1962年，首次在Jasminum grandiflorum中分离出茉莉酸甲酯（MeJA），但茉莉酸在抑制植物生长中的作用直到1980年才被日本和德国科学家发现。在那之后，筛选抑制茉莉酸根生长的突变体已成为JA信号传导途径中的主要工作。大量研究了茉莉酸及其衍生物在植物中的合成途径和方法，发现这些都是通过脂质氧化途径来实现的。当植物受到昆虫和病原体的伤害时，活性茉莉酸在植物中迅速合成[5]。作为植物的天然调节剂，茉莉酸（JA）具有抑制植物生长，萌发，促进衰老和增加抗性的生理功能并且是高等植物中存在的内源生长调节剂。可以诱导植物生长和发育的行为，并且可以对外部环境压力作出反应，例如气孔关闭、抑制Rubisco生物合成、影响植物对N，P和葡萄糖的吸收、有机物运输、抵抗致病性感染、影响开花、、植物衰老、抑制根生长、花粉管形成、卷须卷曲、花丝伸长、雌蕊发育和花药裂开等[6]。有研究表明，茉莉酸受体及其介导的转录机制导致拟南芥开花时间延迟[7]。作为一种转录的抑制因子，JAZ蛋白可用于调节茉莉酸信号，通过SCFCOI1受体复合物，向下游茉莉酸反应基因的转导 [8]。JAZ家族基因从植物中分离并被克隆和研究，由此证明了JAZ家族基因的表达可以降低植物的抗虫性同时还可以延缓植物的花期。

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