B-BOX-box（BBX）是一类锌指蛋白转录因子，也是控制生长和发育过程的调控网络中的关键因子。BBX家族成员众多，也各有功能，包括了幼苗的光形态建成，开花的光周期调控，响应避阴反应，生物胁迫和非生物胁迫等。其中，BBX7又名COL9，在拟南芥和水稻等植物中，通过影响光周期的调控下的CO的表达量来推迟开花时间，但在菊花中还没有进行过相关研究。来自日本的切花菊‘优香’生长旺盛，节间紧簇，叶片宽大，叶色深绿，是很好的实验材料。在本实验中，我们选择‘优香’中的CmBBX7基因作为研究对象。为了预测与验证菊花中BBX7的功能，首先我们对CmBBX7进行了生物信息学分析。分析发现，CmBBX7具有两个BBOX-box结构域和一个CCT结构域。在CmBBX7的二级结构中，数量最多的是无规则卷曲，其次是α螺旋。我们从NCBI数据库中得到了其他6个物种的BBX7蛋白序列与CmBBX7进行比对，发现保守性较高的部分主要集中在靠近N端和C端的BBOX-box和CCT结构域。进一步进行系统进化分析，这7个BBX7蛋白明显归于两个分支，且BnBBX7和CmBBX7在亲缘关系上最接近，这也说明它们在结构和功能上更高的一致性。通过对蛋白基序（Motif）进行分析，结果表明基序在N端的数量与位置更加保守。除此之外，CmBBX7与其他的物种的基序上的差异也表明了它在功能上的特异性。之后我们对7个蛋白三级结构进行预测,结果表明CmBBX7与其他的蛋白有部分明显的不同。之后我们进行了CmBBX7的遗传转化实验，通过农杆菌转化叶盘法将CmBBX7转入菊花‘优香’，一系列的培育和筛选之后得到了符合预期的愈伤组织，并分化出转基因苗。希望我们的实验可以对BBX7进一步的功能的相关研究奠定了基础，甚至是BBX家族的相关研究提供方法和理论依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料3
1．1．1 植物材料3
1．1．2 菌株与质粒3
1．1．3 酶及其他相关试剂3
1.2 方法3
1.2.1 总RNA提取3
1.2.2 总RNA中DNA的消化及cDNA第 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
一条链的合成3
1.2.3 引物设计及PCR扩增4
1.2.4 目的基因的回收纯化5
1.2.5 连接转化5
1.2.6 质粒提取筛选5
1.2.7 目的片段酶切及连接6
1.2.8 目的片段线性化6
1.2.9 表达载体连接及转化6
1.2.10 农杆菌感受态制备及转化7
1.2.11 叶盘法转化菊花7
1.3 基因序列分析及多序列比对7
1.4 系统进化树构建与保守性分析8
1.5 二级结构分析与三级结构预测8
2 结果与分析8
2.1 CmBBX7的克隆鉴定与生物信息学分析8
2.1.1 序列结构分析9
2.1.2 系统进化分析9
2.1.3 结构及保守性分析10
2.2 CmBBX7的遗传转化11
2.2.1 CmBBX7的载体构建11
2.2.2 叶盘法转化菊花11
3 讨论 11
致谢13
参考文献13
菊花CmBBX7基因的克隆和遗传转化
引言
菊花是世界“四大切花”之一，占全球切花数量的30%。菊花是日本国内消费量和消费额最大的切花品种，2003年消费量为20.02亿枝，占切花总消费量的31%，消费额约为996亿日元（合9.96亿美元），占切花总消费额的29%，由此可见，菊花在花卉消费市场中占有举足轻重的地位，而且对菊花的品质有严格的要求，整支花要协调一致[2]。来自日本的‘优香’目前是市场上主栽的切花大菊益种之一，表现为生长旺盛，节间紧簇，叶片宽大，叶色深绿，其自然花期主要集中７月，夏季高温经常会对其花蕾发育和开花造成不同程度的负面影响[3]。切花菊“优香”的花为白色，因其花型正、花头大、茎杆挺拔、叶片平展的形态特点以及花期持久、抗病性强、耐运输等优良特点，越来越受到国内外销售商的青睐。特别是在高温季节，其他切花菊品种花朵受到高温影响出现崎形花，影响商品的观赏价值而无法出口，而“优香”则成为这一时期出口切花菊的主要品种[4]。
Bbox（BBX）蛋白是一类锌指蛋白转录因子，其中包含了一个Bbox结构域，这个结构域有一个或者两个Bbox序列，有些有一个CCT（CONSTANS，COlike和TOC）结构域[5]。BBX蛋白属于一个功能多样的大家族，编码它们的基因与包括包括蓝绿藻类和苔藓在内的所有多细胞生物高度保守[69]。BBX蛋白质的序列比对分析表明，CCT结构域也是高度保守的。CCT结构域由于与组蛋白有些相似，推测其可能具有DNA结合功能[10]。Bbox蛋白是控制生长和发育过程的调控网络中的关键因子，这些过程包括了幼苗的光形态建成，开花的光周期调控，响应避阴反应，生物胁迫和非生物胁迫[7]。而在这个庞大的家族中，我的主要研究对象是BBX7，又名COL9（CONSTANSlike 9 ），编码一个核蛋白，它的表达是受到光周期途径中的生物钟调控的。已有实验结果证明此基因在拟南芥、水稻等植物中，都会通过影响植物的光周期途径，使开花时间推迟。
在拟南芥的研究中，转基因拟南芥中的BBX7的过表达会导致开花延迟，与此同时，在长日照条件下，共抑制和TDNA敲除株系都表现为提前开花。CO是植物开花时间光周期调控途径中的一个重要基因。长日照条件下，co突变植株开花时间有明显推迟，CO过度表达系早于野生型植株开花；短日照条件下，co突变植株和野生型开花时间相同，CO过表达系表现为提前开花。说明CO的表达量是一个限制因子，是一个输入的光和时间信号的中央调节器。在co突变体中，BBX7的过表达并没有表现为延迟开花。在BBX7转基因株系中，CO的过度表达产生的两倍高表达量与单一CO过表达出现了相似的提前开花表型。在COL9转基因株系中，一些与生物钟相关的基因的振荡模式保持不变，与野生型相比，CO和FLOWERING LOCUS T (FT) 的mRNA的丰度都降低了。通过研究表明，COL9通过抑制CO的表达来调控开花时间，同时减少了FT的表达，延迟了开花的时间[11]。
在水稻的研究中，已经验证了BBX7可以提高水稻的稻瘟病抗性，并且在长日照和短日照的条件下，BBX7的过表达都会延迟水稻的开花时间，并导致mRNA水平的EHd1、RFT和Hd3a的表达受到抑制。BBX7的表达在不同的日光条件下表现出两种类型的昼夜节律，并且BBX7可以通过抑制Ehd1光周期的开花途径，可以延迟水稻的抽穗时间。与此相反，之前报道的开花调节因子的表达在BBX7转基因植株上并没有显著的改变，这表明BBX7的调控开花的途径是独立于其他开花途径起作用的。BBX7作为一种潜在的产量基因，它的含量的降低也会降低水稻的主穗的粒数。此外，酵母双杂交试验表明，BBX7与Receptor for Activated Ckinase 1（OsRACK1）相互作用。综合以上的结果可知，BBX7是通过抑制Ehd1途径来延缓水稻的开花时间[12]。
对BBX家族的已经有了较充分的研究，但是因为BBX家族成员众多，对于其中每一个成员的研究不够深入彻底，更不要谈在不同物种中的共同点和差异性了。BBX7在拟南芥、水稻、番茄、油菜、烟草等植物中已有了一些相关报道，但在菊花中却是几乎没有涉猎的，因此我们的实验主要针对菊花中的CmBBX7基因进行了相关的研究和分析，而实验材料选择了夏菊‘优香’。在本实验中，我们首先对CmBBX7进行了生物信息学分析，对它的结构和功能进行了分析和预测。然后从菊花‘优香’中获得目的基因，通过农杆菌转化叶盘法转入‘优香’叶盘中，并通过培育与筛选获得了符合预期的菊花愈伤组织。虽然未能获得转基因的菊花植株以及对其进行检测，但是希望我们的实验可以对BBX7的相关研究，甚至是BBX家族的相关研究提供方法和理论依据。

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