荷花（Nelumbo Nucifera）是一种常见的观赏植物，同时对重金属也具有一定的吸附能力。研究发现，乙烯在调控植物对重金属胁迫响应过程中发挥着重要的作用，ACC合成酶基因（ACS）是乙烯生物合成中的关键基因。为了验证NnACS基因对荷花耐镉性的调控功能，本试验通过农杆菌将其转入拟南芥中，经过DNA鉴定证实目的基因已成功转入。进一步将NnACS在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中进行瞬时表达，结果表明，Cd胁迫下，与未转化烟草（CK）及瞬转1302空载烟草相比，瞬转NnACS烟草的叶片乙烯释放量显著升高，叶绿素含量显著降低，证实过表达NnACS能够增加乙烯生成量、加重Cd对烟草叶片的伤害，从而初步验证了荷花NnACS具有调控耐镉性的功能，为进一步通过基因工程手段提高荷花对重金属的耐受能力提供依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 实验材料 3
1.2 拟南芥侵染与鉴定 3
1.2.1侵染拟南芥 3
1.2.2 T0代拟南芥抗性筛选 3
1.2.3 T0代拟南芥DNA提取与鉴定 3
1.3 烟草瞬时转化鉴定 4
1.3.1 离体烟草叶片浓度筛选 4
1.3.2 烟草瞬时转化 4
1.3.3 叶绿素含量测定 4
1.3.4 乙烯释放量测定 4
2 结果与分析 5
2.1 T0代拟南芥DNA鉴定 5
2.2 荷花NnACS基因耐镉性在烟草瞬时转化中的验证 5
2.2.1 离体烟草叶片Cd浓度筛选结果 6
2.2.2 Cd胁迫下离体烟草叶片表型观察结果 6
2.2.3 Cd胁迫下离体烟草叶片叶绿素含比较 7
2.2.4 Cd胁迫下离体烟草叶片乙烯释放量比较 7
讨论 8
致谢 9
参考文献 9
荷花NnACS基因调控耐镉性功能的初步验证
引言
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近年来随着采矿、冶金、机械制造等重工业的快速发展，工业废料迅速增多，大量重金属元素随着未处理或未处理达标的废料排入水中造成水体污染，其中又以重金属Cd的危害较为严重[1]。对植物而言，Cd是一种非必需元素，当植物体内Cd浓度超过一定范围后，过量Cd会扰乱植物对其他必需金属元素的吸收，植物就会产生明显的受害症状[2]。Cd对植物的毒害作用主要表现在植物表型和生理生化两方面[3]。植物表型上主要表现为生物量下降、生长缓慢、叶片失绿[3]，杨居荣[4]等发现经Cd处理后的几种植物叶片内的叶绿素含量都发生降低，杨明杰[5]实验证明Cd可以使甘蓝叶片发黄、萎缩、叶背面泛紫；生理方面主要表现为光合作用受到抑制以及氧化胁迫和膜损伤[3]，研究表明植物的光合系统对Cd胁迫敏感，Cd胁迫下叶绿素受到较大伤害[6]，进而光合作用减弱，出现叶片泛黄失绿等现象。同时活性氧大量产生，中间产物自由基和丙二醛（MDA）使得植物细胞膜结构遭到破坏[7]，从而对植物造成严重Cd胁迫。水体Cd污染已经成为亟待解决的全球性环境问题。
植物修复是指利用植物本身的植物组织吸收、根系微生物降解和生长基质氧化等作用来去除受损环境中的有害物质的一种修复方式[8]。与传统的物理化学修复方法相比，植物修复简便易行，不易形成二次污染，生态效益好，成本低廉[8]，因而正逐渐成为国内外修复重金属环境污染的一种新兴途径。植物修复包括植物固定、植物降解、根际生物降解、植物提取、植物挥发、根系过滤等几种方式[9]，而水生植物对重金属污染水体的修复主要是通过植物固定来实现的，即重金属排入水中后由液相转为被吸附在底泥中的固相，再通过水生植物将重金属向地上部的茎、叶中转移聚集[10]，另外植物还会通过根系分泌物、改变空气条件、增加微生物数量和种类来促进重金属的吸收固定[11]，从而阻止重金属向周围水体扩散。
荷花（Nelumbo Nucifera）是睡莲科莲属多年生挺水植物，生长于水陆过渡带的潮湿地区，根系发达，广泛应用于园林造景且具有一定经济效益[12]。同时荷花的生态效益也不容忽视，宋力[13]等人实验证明，荷花对沉积物中Cd的去除率可高达36.7%，经荷花修复后的沉积物中重金属以残渣态存在，不易被生物吸收[13]，大大减轻了重金属对动植物的毒害作用。因此荷花是一种潜力巨大的修复植物，对污染水体有良好的净化作用。
乙烯（C2H4）是一种具有生物活性的气体激素，在植物整个生命周期中都发挥着作用[14]。在重金属毒害、冷害、涝害等逆境胁迫下，乙烯可作为內源信号分子将外界胁迫信号传导至细胞[15]，使植物作出相应应答，是植物体内非常重要的一种胁迫激素。1964年Liberman等提出乙烯来源于蛋氨酸(Met)，1979年Adams和Yang证明ACC是乙烯合成的直接前体[16]，至此确定了高等植物乙烯合成途径：蛋氨酸（Met）经过腺苷蛋氨酸合成酶（SAM合成酶）催化生成S－腺苷甲硫氨酸（SAM），SAM在ACC合成酶（ACC synthase,ACS）的催化下生成1－氨基环丙烷－1－羧酸（ACC），最后由ACC氧化酶（ACO）在有氧条件下催化ACC 氧化为乙烯[16]。ACC合成酶(ACS)是乙烯生物合成过程中的限速酶[17],ACS基因则最早在番茄果皮中被发现[18]，由多基因家族编码[19]。一般认为特定的逆境胁迫可诱导或抑制特定ACS基因的表达[20]，从而增加或减少乙烯合成量，调节植物对不同逆境胁迫的响应，例如拟南芥下胚轴的横切伤害刺激诱导AtACS2, 4, 6, 7, 8,11 的表达[21]，ACS5和ACS11的表达在低温下受到抑制[22]等。另外重金属胁迫也会诱导相应ACS基因的表达，例如Cd会显著地提高ACS2、ACS6和ACS7的表达水平[23]，臭氧和Cu2+ 胁迫下马铃薯叶片中ACS4和ACS5基因表达上调 [24]，LiCl处理则会诱导AtACS5 基因的表达[25]。由此可见，ACS基因在植物应对重金属胁迫中起到重要作用。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种重要的模式植物，以其植株体积小、生长周期短、基因组全序列测序完成以及易获得大量突变体等优点而被广泛应用于植物生物学研究中[26]。对烟草进行瞬时转化，可在短时间实现外源基因的快速表达和功能验证[27]，农杆菌介导的叶片注射渗透转化法方便快捷，感染组织面积大，因此近年来在基因功能检测领域得到广泛应用[28]。
本课题组前期研究发现，乙烯在荷花响应Cd胁迫的过程中起重要作用。为进一步研究乙烯调控荷花耐镉性的机制，本试验以‘微山湖红莲’（‘Weishanhuhonglian’）实生苗为试验材料，在克隆得到NnACS基因的基础上，用农杆菌侵染拟南芥，通过DNA鉴定证实目的基因已成功转入拟南芥中，然后进一步将NnACS基因在本氏烟草中进行瞬时表达，对NnACS调控耐镉性的功能做出初步验证，为通过基因工程技术改良荷花耐镉性，提高重金属污染水体修复效率提供一定依据。

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